摘要
目的: 慢性内脏痛是肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)等临床疾病的常见特征。目前中枢敏化是慢性内脏痛敏的重要机制，其中丘脑连结核(thalamic nucleus reuniens，Re)是参与痛觉信息处理的重要中枢核团之一。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)神经递质系统在内脏痛敏反应中起着重要的作用，然而5-HT2B受体在内脏疼痛中的作用目前尚不清楚。因此，本研究的目的是研究Re区域谷氨酸能神经元上的5-HT2B受体对新生期母爱剥夺(Neonatal Maternal Deprivation，NMD)模型小鼠慢性内脏痛敏反应的影响。 方法: 1.NMD的慢性内脏痛敏模型建立:C57BL/6J小鼠降生第二天开始，雄性幼鼠每天和母鼠隔离三小时，造模持续十四天之后终止，造模小鼠为实验组(NMD)，不做任何处理的小鼠作为对照组(CON)，待造模小鼠长至成年后进行实验。 2.痛阈行为学检测:应用结直肠扩张(Colorectal distension，CRD)诱发的腹壁反射阈值与腹壁肌电(Electromyogram，EMG)曲线下面积(Area under the cure，AUC)来定量NMD小鼠内脏痛敏反应。 3.单通道记录实验:单电极检测CON组与NMD组小鼠Re右侧区域单个细胞平均放电频率。 4.分子表达检测:采用Western blotting、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测CON组与NMD组小鼠Re内5-HT2B受体的蛋白表达水平与mRNA表达水平。 5.免疫荧光实验:分别检测成年CON组、NMD组、CON+CRD刺激组、NMD+CRD刺激组小鼠Re区域c-fos表达以及NMD+CRD刺激后Re右侧区域注射5-HT2B受体拮抗剂RS-127445检测c-fos表达，并检测5-HT2B受体在Re的表达情况及其所在神经元的类型。 6.Re核团内微量注射与光遗传检测:Re右侧区域内微量注射腺相关病毒(rAAV2/9-CaMKⅡα-ChR2-EYFP，rAAV2/9-CaMKⅡα-eNpHR-EYFP)后结合光刺激来检测EMG的AUC变化。 7.药理学方法:Re右侧区域微量注射5-HT2B受体选择性拮抗剂RS-127445，检测成年NMD小鼠内脏痛阈值以及EMG的AUC变化。 8.全细胞脑片膜片钳记录实验:将CON与NMD小鼠分别进行灌流、取脑、振动切片，然后记录Re区域神经元兴奋性与突触传递的特征。 结果: 1.与同龄的对照组比较，成年NMD小鼠EMG的AUC显著增大。免疫荧光试验表明给予CRD刺激后的NMD小鼠Re中c-fos+神经元的表达数量明显提高，并与谷氨酸能神经元共标。 2.在体电生理记录显示，NMD小鼠Re区域平均细胞放电频率显著高于CON组小鼠平均放电频率。 3.离体脑片记录表明，与CON小鼠相比，NMD小鼠Re区域内神经元的兴奋性显著增强，自发兴奋性突触传递频率显著增强。 4.给予NMD小鼠黄光抑制Re区域谷氨酸能神经元，显著降低CRD诱发的EMG曲线下面积，缓解NMD小鼠内脏痛敏。 5.给予CON小鼠蓝光激活Re区域谷氨酸能神经元，显著升高CRD诱发的EMG曲线下面积，增强CON小鼠内脏痛敏。 6.与CON小鼠相比，NMD小鼠Re区域5-HT2B受体的表达显著升高，并且5-HT2B受体与兴奋性谷氨酸能神经元(Glutamate)大量共定位。此外，NMD小鼠Re区域内5-HT2B受体阳性兴奋性神经元的百分比显著增高，与Glutamate共定位率显著高于CON小鼠。 7.Re右侧区域微量注射5-HT2B受体拮抗剂RS-127445(1μL)显著提高NMD小鼠内脏痛阈值，RS-127445(3μM、10μM)有效作用时间为给药后1h到6h，RS-127445(30μM、100μM)有效作用时间为给药后0.25h到6h。Re右侧区域微量注射RS-127445(30μM，1μL)后，明显降低EMG的AUC。 8.Re右侧区域微量注射5-HT2B受体拮抗剂RS-127445(30μM，1μL)明显抑制NMD小鼠Re区域c-fos+神经元的表达。 9.孵育RS-127445显著降低NMD小鼠Re区域sEPSC的频率，而不影响sEPSC的幅度，提示5-HT2B受体能够增强自发性兴奋性突触传递。 结论: NMD小鼠Re区域c-fos阳性的谷氨酸能神经元数量增多以及细胞放电频率增强，并且神经元兴奋性与突触传递频率增强，表明Re区域参与小鼠慢性内脏疼痛。抑制Re区域谷氨酸能神经元活性与Re区域5-HT2B受体活性均明显减轻小鼠内脏痛敏反应，证明了Re区域谷氨酸能神经元上的5-HT2B受体参与小鼠内脏疼痛。总之，5-HT2B受体可能是Re参与NMD小鼠慢性内脏痛敏的关键分子，针对Re区域以及Re区域5-HT2B受体的相关药物研发可能是治疗慢性内脏痛的潜在新靶点。
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