摘要
阿霉素是蒽环类抗肿瘤药物的代表药，其抗瘤谱广，疗效确切，广泛应用于成人及儿童的多种肿瘤的化疗当中。然而，阿霉素的心脏毒性突出，不仅发生率高，且预后差，严重影响阿霉素的临床应用及患者生存质量。氧化应激是阿霉素心脏毒性的重要机制，而阿霉素损伤的心肌线粒体是活性氧的重要来源。由于心肌细胞的抗氧化系统相对有限，自噬成为其重要的抗氧化机制之一，近年来的研究发现溶酶体功能障碍及其引发的自噬功能紊乱会加重阿霉素相关心肌损伤。然而，阿霉素心脏毒性的病生机制非常复杂，目前针对性的防治手段十分有限且可能减弱阿霉素的抗肿瘤效果。因此，继续深入探讨阿霉素心脏毒性的病生理机制并开发高效低毒的治疗药物具有重要性和迫切性。 阿霉素引起的心肌组织内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide，NAD+)耗竭推动了阿霉素心脏毒性的发展。NAD+参与维持细胞氧化还原稳态及DNA损伤修复、蛋白去乙酰化等过程，对于维持线粒体、溶酶体等细胞器的正常功能至关重要。既往研究表明，对于包括阿霉素心肌损伤在内的多种心脏疾病，增加NAD+水平是一种有前景的治疗策略。烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)作为NAD+的前体化合物，对于衰老、缺血/再灌注、肥胖等因素导致的心肌损伤具有良好的改善作用，近期的两项研究也显示，NMN可以减轻阿霉素心脏毒性。然而，NMN对于阿霉素相关心肌损伤的改善作用仍需更多的证据支持，其作用机制目前仍不清楚。此外，NMN对于阿霉素本身抗肿瘤药效的影响也有待探讨。 基于以上，本研究在体内、体外层面上探讨NMN对阿霉素相关心肌损伤的药效，并观察了NMN对阿霉素的抗肿瘤作用有无影响。在确立了NMN药效的基础上，本研究从改善线粒体及溶酶体功能角度探讨了NMN抗阿霉素心肌损伤的作用机制。 目的: 1.评价NMN是否改善阿霉素相关心肌损伤且不影响其抗肿瘤活性; 2.观察NMN对阿霉素诱导的心肌细胞线粒体氧化应激的影响及其在改善阿霉素心肌损伤中的作用; 3.探讨NMN对阿霉素诱导的心肌细胞溶酶体损伤的改善作用; 4.明确NMN对阿霉素导致的心肌细胞溶酶体功能的改善作用是否与抑制线粒体活性氧的生成有关。 方法: 1.采用C57BL/6小鼠单次腹腔注射阿霉素建立阿霉素急性心肌损伤模型，同时腹腔注射NMN进行干预或等体积生理盐水作为对照，5天后，超声心动法检测心脏收缩功能，ELISA法检测血清中Troponin I及CK-MB水平，HE染色法观察心肌组织结构，伊文思蓝染色观察心肌细胞死亡，天狼星红染色法检测心肌组织胶原沉积;分离心肌组织线粒体，比色法检测线粒体内NAD+水平，荧光光谱法检测活性氧生成。比色法检测心肌组织蛋白羰基化及脂质氧化损伤水平，Western Blot法及荧光定量PCR法检测Bnip3的表达。 2.采用大鼠胚胎心肌细胞系H9c2细胞和新生小鼠原代心肌细胞建立阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型，用NMN进行干预，比色法检测细胞内NAD+水平;检测心肌细胞存活率、LDH漏出以评价细胞损伤;检测caspase-3活性、caspase-3剪切体水平及DNA碎片化以观察细胞凋亡水平;MitoSOXTM染色法检测线粒体活性氧水平，生物发光法检测ATP的生成，Western Blot法检测Bnip3表达水平;LYSO-ID?Red染色法检测溶酶体损伤，LysoSensorTM Yellow/Blue DND-160染色法检测溶酶体pH，Western Blot法检测cathepsin B表达及自噬流。在此基础上，观察联用溶酶体酸化抑制剂巴弗洛霉素A是否减弱甚至取消NMN对阿霉素损伤心肌的保护作用，以探究NMN是否通过改善溶酶体功能、调节自噬发挥抗阿霉素心肌病作用。 3.在阿霉素损伤的H9c2细胞中，观察线粒体靶向活性氧清除剂mito-Tempo对心肌细胞凋亡、溶酶体损伤、溶酶体pH、cathepsin B表达及自噬流的影响，探究抑制线粒体活性氧是否可以改善溶酶体功能异常。进一步通过免疫沉淀与DNP衍生相结合的手段，观察NMN及mito-Tempo对溶酶体中关键分子ATP6VOD1的氧化修饰状态的影响。 4.采用体外培养乳腺癌细胞及乳腺癌荷瘤裸鼠模型，观察NMN单用及与阿霉素联用时肿瘤的生长情况，评价NMN对阿霉素抗肿瘤作用的影响。 结果: 1.在培养的心肌细胞中，NMN能够增加细胞内NAD+水平，减轻阿霉素导致的细胞损伤，减少细胞凋亡。在阿霉素心肌损伤小鼠模型中，NMN能减轻阿霉素染毒小鼠心肌损伤，改善左室收缩功能及心肌结构，减少心肌细胞死亡。 2.NMN不会促进培养的乳腺癌细胞增殖，也不减弱阿霉素对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。在乳腺癌荷瘤裸鼠模型中，NMN不促进乳腺癌皮下移植瘤的生长，也不影响阿霉素的体内抑瘤作用。 3.在小鼠模型中，NMN增加阿霉素染毒小鼠心肌组织线粒体内NAD+水平，减少线粒体活性氧生成，减轻心肌组织氧化损伤。而在培养的心肌细胞中，NMN抑制阿霉素损伤心肌细胞线粒体活性氧生成，增加ATP的含量。 4.NMN减轻阿霉素诱导的心肌细胞中溶酶体损伤，改善溶酶体酸化及功能，疏通自噬流。抑制溶酶体酸化减弱NMN对阿霉素损伤心肌细胞的保护作用。 5.线粒体靶向活性氧清除剂mito-Tempo能够减轻阿霉素诱导的心肌细胞损伤，减少细胞凋亡;mito-Tempo减轻阿霉素诱导的心肌细胞中溶酶体损伤，改善溶酶体酸化及功能，疏通自噬流。 6.NMN及mito-Tempo均可抑制阿霉素导致的心肌细胞ATP6V0d1氧化修饰。 结论: 1.NMN可减轻阿霉素相关心肌损伤，且不影响阿霉素的抗乳腺肿瘤活性。 2.NMN的抗阿霉素心肌损伤作用与抑制线粒体活性氧生成有关。 3.NMN通过改善心肌细胞溶酶体功能抵抗阿霉素心肌损伤。 4.NMN通过减少线粒体活性氧的生成减轻阿霉素诱导的心肌细胞溶酶体损伤。 意义: 本研究为NMN对阿霉素心脏毒性的治疗作用提供了重要的理论依据，并为NMN用于阿霉素相关心肌损伤的临床治疗提供了参考信息。
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