摘要
帕金森病(Parkinson Disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，其病理特征为中脑黑质多巴胺能(Dopaminergic，DA)神经元退化死亡。由于成人中枢神经系统的修复能力有限，缺失的神经细胞无法再生。人多能干细胞(Human Pluripotent Stem Cells，hPSCs)来源的DA神经元具有广阔的临床应用前景。在过去的十年中，多个研究小组开发了从hPSCs分化DA神经元的方法。分化诱导策略模拟了体内DA发育的因子和通路调控:使用SMAD通路抑制剂促使hPSCs向神经方向分化，通过激活Shh信号和Wnt信号，进一步将神经细胞特化为中脑腹侧底板细胞，随后加入FGF8将底板细胞尾侧化为多巴胺能神经前体细胞(Dopaminergic Precursors，DAP)，确定了其向DA神经元的转变。但是，现有的分化方案存在分化效率低和分化细胞异质性大的问题。移植物中存在星形胶质细胞、血管软脑膜细胞和非DA神经元，这些杂质细胞不但影响DA神经元的体内功能评价，还会带来潜在的安全性风险。因此，鉴别非DAP的标志物并寻找纯化目的细胞的方法，最终获得更高质量的细胞是领域内有待解决的关键问题，需要对DA神经元体外分化的命运调控进行深入解析。 本论文先通过中脑底板诱导策略在2D条件下将人胚干细胞(HumanEmbryonic Stem Cells，hESCs)分化为DAP，选取不同时间点进行单细胞转录组测序和分析，旨在研究hESCs衍生的DAP的分化路径，寻找命运选择关键节点，并解析各阶段的细胞组成。通过命运轨迹分析确定了3个关键分化节点，发现分化早期OTX2低表达是非预期分化细胞的主要特征。进一步通过分析DAP和非DAP之间的差异表达基因，确定了不同阶段非DAP细胞群的分子特征。通过对部分差异基因进过表达分析发现LGI1可以促进DAP的分化。同时发现，脉络丛上皮细胞是主要的非DAP细胞类型，CD99是其特异表达的表面标志物，可用于纯化富集DAP。 以上结果也说明，细胞在培养液处理下会自发产生异质性，基于此，我们开发了多因子脉冲处理的培养方法，在3D条件下将hESCs分化为带有极性的神经类器官。本论文对分化至第20天和60天的类器官分别进行单细胞转录组测序，揭示了该类器官中包含中脑底板细胞、DAP、DA神经元和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神经元。免疫荧光检测也证实该类器官主要包含前脑纹状体GABA神经元和中脑DA神经元，是模拟黑质一纹状体单元的新类器官模型，而且利用该模型筛选出了能够特异损伤DA神经元的环境毒素氯苯恶唑胺，证明该模型有望用于药物的神经毒理评价和化合物筛选。 综上，本论文的研究成果为DA神经元的高效获得、质量控制，以及帕金森病体外模型的开发提供了支持。
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