摘要
心血管疾病是全球的头号死因，动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病因。动脉血管壁长期暴露于危险因素(如血液动力学的变化，高血脂症，高血压，氧化应激等)，可导致血管内皮细胞功能受损，大量脂质沉积于内皮细胞下，促进白细胞浸润和平滑肌细胞增生，形成动脉粥样硬化斑块。斑块破裂导致动脉血栓形成，血栓完全或部分阻塞受累动脉引发的急性临床事件(如心肌梗死，脑卒中)使患者致死致残，严重影响人们的身体健康和生活质量。因此，深入研究动脉粥样硬化的发病过程和分子机制，寻找动脉粥样硬化防治靶点具有十分重要的意义。 动脉血管的弯曲或分叉处易产生扰动流，是动脉粥样硬化斑块好发部位。虽然血小板被认为参与动脉粥样硬化的发生发展和动脉粥样硬化血栓形成，但其在扰动流诱导的动脉粥样硬化斑块形成中的作用尚不十分清楚。本研究利用颈动脉部分结扎的扰动流体内模型和动脉粥样硬化小鼠模型，发现扰动流可诱导血小板在内皮下和动脉粥样硬化斑块中积聚，并且这一过程依赖于血小板CLEC-2和单核/巨噬细胞Podoplanin的相互作用。研究结果提供了血小板参与动脉粥样硬化的直接证据，有望为动脉粥样硬化的预防和干预提供潜在靶点。 目的: 探究血小板在扰动流诱导的小鼠动脉粥样硬化斑块形成中的作用，为动脉粥样硬化的预防和干预提供理论依据和有效靶点。 方法: 1.扰动流诱导的血小板在血管内皮下和动脉粥样硬化斑块中的积聚 (1)小鼠动脉粥样硬化斑块模型的构建。①小鼠颈动脉粥样硬化斑块模型:对成年ApoE-/-和Ldl-r-/--小鼠实施颈动脉部分结扎术(Partial carotid ligation，PCL)手术，即结扎小鼠左颈动脉三个分支(颈内动脉，颈外动脉，枕动脉)，仅留甲状腺上动脉使其左颈总动脉(Left common carotid artery，LCA)远心端产生扰动流，之后喂食高脂饲料1周或4周诱导小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成。②小鼠主动脉粥样硬化斑块模型:给成年ApoE-/-和三以一小鼠喂食高脂饲料4周或12周诱导小鼠主动脉弓粥样硬化斑块形成。 (2)免疫荧光染色观察血小板在斑块内积聚。对小鼠颈动脉和主动脉弓斑块进行常规冰冻切片免疫荧光染色，用CD42d荧光抗体观察扰动流模型结合高脂饮食诱导的颈动脉斑块及单纯高脂饮食诱导的主动脉弓斑块中的血小板。 (3)免疫荧光染色观察血小板在内皮下积聚。在野生型C57BL/6J小鼠(wild type，WT)左颈动脉上构建扰动流模型，通过全组织enface染色，冰冻切片免疫荧光染色，三维重构技术观察扰动流发生区域的血小板。 (4)透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)检测左颈总动脉扰动流发生区域血小板在内皮下积聚。对WT小鼠进行PCL手术，2天后取样，2.5％戊二醛固定血管，锇酸染色制样后通过TEM观察扰动流发生区域血管壁的超微结构。 (5)整合素β3缺失对血小板内皮下积聚的影响。将整合素β3敲除小鼠的骨髓细胞移植至WT小鼠中构建造血系统整合素β3缺失的嵌合鼠。在此小鼠的左颈动脉进行PCL手术，通过en face染色和三维重构技术观察扰动流发生区域的血小板。 2.扰动流诱导的血小板内皮下积聚与白细胞浸润的动态观察 (1)血小板、中性粒细胞和单核细胞在内皮下的积聚与扰动流发生时间的相关性。通过冰冻切片免疫荧光染色观察PCL手术不同时间段(30min，3h，6h，1d，2d，5d，7d，14d，28d)，血小板、中性粒细胞和单核细胞在扰动流发生区域的浸润情况。 (2)扰动流发生区域内皮下血小板与浸润白细胞的相互接触。通过三维重构技术观察PCL手术2天后左颈总动脉浸润细胞的分布情况，通过Imaris contact插件定量分析扰动流发生区域血小板与单核细胞或中性粒细胞的相互接触。 结果: 1.扰动流诱导血小板在内皮下和动脉粥样硬化斑块中积聚 (1)扰动流模型的构建及评估。为了观察扰动流诱导血小板在内皮下或斑块内积聚，我们利用颈动脉部分结扎术(PCL)建立扰动流模型，该模型结合高脂饲料喂食可在1～4周内快速诱导Ldl-r-/-或ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块的发生。PCL术后小鼠左颈总动脉血流流速下降为对照的1/3～1/4，且出现反向流，证明本扰动流小鼠模型构建成功。 (2)小鼠动脉粥样硬化斑块中可检测到血小板。利用扰动流诱导的颈动脉粥样硬化斑块模型，通过冰冻切片免疫荧光染色观察斑块内的血小板。结果显示在动脉粥样硬化易感Ldl-r-/-或ApoE-/-鼠中，PCL术后高脂饮食1周形成的颈动脉斑块内部可检测到血小板，而PCL术后高脂饮食4周的颈动脉斑块内部未检测到血小板。进而，我们通过单纯高脂饮食观察了主动脉弓动脉粥样硬化斑块中的血小板。结果表明喂食高脂饲料4周的主动脉弓斑块中可观察到血小板，而喂食高脂12周观察不到血小板。因此，两种模型均表明血小板较早出现在动脉粥样硬化斑块中。 (3)扰动流诱导血小板在颈动脉血管内皮下积聚。鉴于血小板在扰动流诱导的动脉粥样硬化斑块中存在，我们推测扰动流诱导血小板进入内皮下。为了证明这一设想，我们采用扰动流模型，观察了PCL手术后WT小鼠左颈总动脉血管壁的血小板。En face染色表明PCL术后2天，血小板不仅在受损内皮细胞上粘附，且部分在内皮下积聚。我们进一步利用体外血小板输注实验，证明了内皮下积聚的血小板来源于循环血细胞。这些结果表明扰动流诱导循环血小板进入内皮下。 2.扰动流诱导的血小板内皮下积聚主要与单核/巨噬细胞相关 (1)血小板、中性粒细胞和单核细胞在内皮下的积聚与扰动流发生时间相关。PCL时间点实验结果表明中性粒细胞最早响应扰动流，在PCL30分钟后开始黏附于内皮细胞，7天后基本消失;血小板次之，在PCL3小时后开始黏附;单核细胞最晚，在PCL6小时后开始黏附:血小板和单核/巨噬细胞持续存在至PCL14天，PCL1天后可在内皮下检测到积聚的血小板、中性粒细胞、单核/巨噬细胞，PCL2天是三类细胞在内膜浸润的峰值期，且各类细胞在内皮下积聚的趋势与其在内膜浸润趋势一致。 (2)血小板在内皮下主要与白细胞尤其是单核/巨噬细胞形成聚集体。三维重构结果显示在扰动流诱导细胞浸润过程中血小板与白细胞相互接触体积占血小板总体积的85％左右，其中血小板与单核/巨噬细胞相互接触体积占比高达57.48％，与中性粒细胞占比约26.17％，还有部分血小板独立存在。 3.血小板CLEC-2和单核/巨噬细胞PDPN相互作用调控扰动流诱导的血小板在内皮下积聚 (1)血小板CLEC-2缺失降低扰动流诱导的血小板在内皮下积聚。体外流式实验结果表明血小板CLEC-2缺失抑制了循环血小板和单核细胞聚集体形成。体内，在Clec2f/f;Pf4-cre和对照Clec2f/f鼠上构建扰动流模型，通过en face和冰冻切片免疫荧光染色检测血小板在血管壁积聚，结果显示血小板CLEC-2缺失明显抑制了扰动流诱导的早期(PCL2天)血小板在内膜上粘附及内皮下积聚。 (2)髓系PDPN缺失降低扰动流诱导的血小板在内皮下积聚。对WT小鼠PCL2天后扰动流发生区域的PDPN表达进行分析，enface染色结果表明PCL手术后，PDPN高表达且与浸润的单核/巨噬细胞共定位。在PDPNf/f;LysM-cre鼠和对照PDPNf/f鼠上构建扰动流模型，冰冻切片免疫荧光染色结果显示髓系PDPN缺失可降低扰动流诱导的早期(PCL2天)血小板在内皮下积聚。 (3)血小板CLEC-2调控RAW264.7细胞迁移和RAW264.7细胞-血小板聚集体的形成。qPCR和流式细胞术实验表明血小板可促进RAW264.7细胞表达PDPN和炎症因子IL-1β，MCP-1;Transwell实验结果表明血小板可促进RAW264.7细胞迁移，而血小板CLEC-2缺失抑制了RAW264.7细胞迁移;流式细胞术结果进一步表明血小板CLEC-2缺失抑制了RAW264.7细胞.血小板聚集体的形成。 4.血小板CLEC-2缺失减缓小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成。 成功构建血小板CLEC-2缺失的Ldl-r-/-嵌合鼠，在此鼠上进行PCL手术，高脂喂食3周诱导颈动脉粥样硬化斑块，通过冰冻切片免疫荧光染色观察斑块大小和细胞浸润，结果表明血小板CLEC-2缺失的Ldl-r-/-嵌合鼠中颈动脉粥样硬化斑块面积显著减小，且斑块中单核/巨噬细胞的浸润减少。 结论: 1.血小板在扰动流诱导的动脉粥样硬化斑块中存在。 2.扰动流可诱导血小板在颈动脉内皮下积聚，此过程需要血小板活化。 3.血小板主要与单核/巨噬细胞相互作用参与扰动流诱导的血小板在内皮下积聚。 4.血小板CLEC-2和单核/巨噬细胞PDPN相互作用调控血小板-单核细胞聚集体形成及扰动流诱导的血小板在内皮下积聚。 5.血小板CLEC-2缺失减缓小鼠颈动脉粥样硬化斑块的形成。
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