摘要
ATP(三磷酸腺苷)作为常见的生物小分子，在细胞中发挥着极为重要的作用。ATP参与了许多细胞生命过程，包括蛋白质合成、DNA复制、酶促反应、调控离子通道、细胞通讯等。同时，ATP与多种疾病密切相关，如炎症、心血管疾病、阿尔兹海默症等。检测细胞内ATP对理解ATP相关的生理学和病理学过程尤为重要。然而，ATP相关的生理学和病理学过程极其复杂，常常涉及到多个细胞器和细胞位点，且时间跨度长。这对ATP传感器的性能提出了极高要求。ATP传感器只有同时具备低毒性、高空间分辨率、优异的稳定性、较好的可逆性、较高的灵敏度和优良的选择性，才能更好地观察和监测细胞内ATP，进而深刻理解相关的生理学和病理学过程。 在现有的ATP传感器中，ATP荧光传感器具有灵敏度高、选择性好、非接触式无创检测等优点，被广泛应用于细胞内ATP检测。其中，最具代表性的ATP荧光传感器包括:ATP适配体荧光传感器和罗丹明型ATP荧光传感器。其中ATP适配体荧光传感器具有极好的生物相容性，对ATP具有很高的灵敏度和优异的选择性。然而，现有的ATP适配体荧光传感器存在设计复杂、空间分辨率低、可逆性差、单一的ATP适配体难以进入细胞等问题。为使ATP适配体进入细胞，往往需要在传感器中引入纳米材料作为载体，这极大影响了ATP适配体本身的生物相容性。罗丹明型ATP荧光传感器信噪比高，对ATP具有很好的灵敏度、选择性和循环可逆性。然而，其存在光稳定性差、空间分辨率低等问题。尽管一些ATP适配体荧光传感器和罗丹明型ATP荧光传感器已经能够实现细胞内ATP检测，上述缺陷仍然难以完全克服，极大制约了ATP相关的生理学和病理学过程研究。因此，发展新型ATP荧光传感器对ATP检测具有十分重要的意义。 本文设计和发展了三种新型ATP荧光传感器，主要工作概括如下: 1.我们巧妙地利用ATP对荧光团的猝灭特性，制备了无猝灭剂型ATP适配体荧光传感器，避免引入纳米颗粒和猝灭剂单元。传感器的结构仅包括:ATP适配体和修饰在ATP适配体5’末端或3’末端的荧光团。由于ATP适配体能够高效地、特异性地结合ATP，进而缩近了ATP与ATP适配体末端荧光团之间的空间距离，使得ATP对荧光团的猝灭效应得到提高，传感器对ATP表现出很高的灵敏度。利用该传感器，我们观测到了由Ca2+及寡霉素诱导的细胞内ATP变化。此外，我们发现该无猝灭剂型ATP适配体荧光传感器的制备策略对其它分析物和荧光团具有普适性。基于此，我们成功合成了无猝灭剂型Cu2+、Ag+、Hg2+以及多巴胺适配体荧光传感器，且制备了具有三种不同荧光团的无猝灭剂型Cu2+适配体荧光传感器。借助无猝灭剂型Cu2+适配体荧光传感器，我们实现了复杂水样中Cu2+检测。 2.我们选用硅纳米线(SiNWs)作为基底、异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明B二亚乙基三胺(Rho-N3H5)作为ATP响应单元，构建了一维纳米线基ATP荧光传感器(SiNWs-FITC@SiO2-Rho)。SiNWs-FITC@SiO2-Rho对ATP表现出较好的灵敏度、极佳的选择性、优良的循环可逆性和优异的稳定性。同时，检测过程中SiNWs-FITC@SiO2-Rho几乎没有空间漂移，具有高的空间分辨率。我们将该传感器应用于细胞内ATP检测，成功实现了细胞核和细胞质ATP的同步检测，原位观测到了Ca2+和寡霉素处理过程中以及顺铂诱导的细胞凋亡过程中细胞质和细胞核ATP的变化。 3.ATP/ADP比值是衡量细胞能量状态的重要指标。然而，现有的ATP/ADP荧光传感器都属于蛋白型荧光传感器，其设计复杂、操作难度大，限制了其应用范围。在本工作中，我们选用聚甲基丙烯酸纳米颗粒作为基底材料，在其表面修饰ATP适配体响应单元和罗丹明型ATP响应单元，构建了能够检测ATP/ADP比值的荧光传感器。由于ATP适配体对ATP和ADP的结合能力相当，因此，ATP适配体响应单元检测的是ATP和ADP总量。而罗丹明型ATP荧光响应单元能够很好地区分ATP和ADP，其对ATP具有更高的亲和力，而对ADP的响应并不灵敏，其测试结果反映的是ATP水平。结合两种ATP荧光响应单元的信号，我们即可得到ATP/ADP比值信息。目前，我们已经完成了该传感器的制备，并完成了传感器的部分光谱学测定。该工作有待进一步的研究。
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