摘要
寄生生物普遍存在着通过操纵宿主细胞蛋白质表达、物质代谢、信号转导系统、宿主行为来实现生长、繁殖和传播目的的现象，昆虫杆状病毒便是一种典型代表。1891年，Hoffmann首次对昆虫受到杆状病毒影响发生行为变化的现象进行了描述并将其命名为“树顶病”。杆状病毒感染可引发宿主的一系列行为变化，包括造成宿主龄期延长、运动行为异常活跃和死亡前的爬行至高处的行为等，但行为变化的诱导机制尚不清楚。本研究以舞毒蛾核型多角体病毒（Lymantriadisparmultiplenucleopolyhedrovirus，LdMNPV）感染舞毒蛾（Lymantriadispar，Ld）幼虫后发生的“树顶病”为研究对象,基于染病幼虫的存活率、病毒多角体基质蛋白基因的表达量和行为变化的结果，通过对四个时间点的感染病毒和未感染病毒的舞毒蛾三龄幼虫进行了转录组学、代谢组织学和相关信号通路功能分析，探究“树顶病”发生的机理。研究获得的主要结果如下： 1.不同处理下的四组(NB3,CK3,Ld3和Ld6)舞毒蛾三龄幼虫的十二个样本进行转录组测序并拼接后使用GO、Pfam、Swissporot、KOG、eggNOG、Nr、和KEGG数据库对Unigene序列进行功能注释。分析结果显示宿主基因变化涉及能量利用、物质合成利用和细胞内信号转导的多个方面。感染病毒后的第3天（Ld3组）和第6天（Ld6组）之间亦具有较大差异，表明病毒在产生子代病毒粒子BVs和ODVs两个阶段对宿主调控存在差异。细胞信号转导相关通路在病毒感染后出现剧烈变化，由于PI3K/AKT信号通路不仅是病毒调控宿主细胞的关键途径，同时也是参与昆虫生理调控的重要信号通路，因此推测PI3K/AKT信号通路内基因波动可能与病毒与宿主细胞相互作用相关。 2.在正离子模式和负离子模式下分别对不同处理下的四组（NB3、CK3、Ld3和Ld6）舞毒蛾三龄幼虫的二十四个样本进行非靶向代谢物测定，使用KEGG注释所测得代谢物。感染后GABA能突触通路、谷氨酸能突触通路、ABC转运通路、神经活性配体-受体相互作用通路、胰岛素抵抗通路和磷脂酰肌醇信号系统通路随着感染后时间点变化出现差异，推测病毒感染可能对影响宿主的神经系统和信号转导系统造成影响。具体分析显示感染早期产生出芽型子代病毒粒子阶段神经递质出现少量变化，信号通路内代谢物出现变化；感染晚期产生包埋型子代病毒粒子阶段发生变化的代谢物则主要涵盖了生长发育相关的激素和以磷酸信号为主的信号转导通路。 3.联合分析筛选出正离子模式下的52条通路中存在差异表达基因和差异代谢物的变化具有相关性，而负离子模式下则为56条通路中存在差异表达基因和差异代谢物的变化具有相关性。根据被感染的幼虫和未被感染的健康舞毒蛾三龄幼虫之间差异基因和差异代谢物生理功能推测神经递质和环己醇的差异可能与感染后宿主行为变化更为相关。特别是PI3K/AKT信号相关通路中产生出芽型病毒粒子阶段肌醇（myo-inositol，MI）积累同时磷脂酰肌醇（phosphatidyl-1D-myo-inositol，PI）含量降低，肌醇聚磷酸5-磷酸酶（inositolpolyphosphate5-phosphatase，INPP5A）和磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶（phosphatidylinositol-4-phosphate3-kinase，PI3K）基因表达上调，肌醇1,4,5-三磷酸受体（inositol1,4,5-triphosphatereceptor，IP3R）基因表达下调。在产生包埋型病毒粒子阶段PI积累而MI减少，同时磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶（phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate3-phosphatase，PTEN）、多肌醇聚磷酸酶/2,3-二磷酸甘油酸3-磷酸酶（multipleinositol-polyphosphatephosphatase/2,3-bisphosphoglycerate3-phosphatase，MINPP1）和IP3R基因表达上调，PI3K基因表达下调，这些变化可能与病毒感染导致的舞毒蛾幼虫的龄期延长和感染后期出现的行为活跃现象存在一定关系。 4.根据PI3K/AKT信号通路发生变化的十八个基因的蛋白序列基础分析和表达动态分析结果，十五个基因被选取作为后续RNA干扰试验的目标基因。本实验成功构建了十五个目标基因的dsRNA原核表达载体并对最佳诱导时长进行筛选。经口饲喂pten-dsRNA进行干扰后的一系列生物学测定显示饲喂后72小时的干扰效率为67.43%，生物学测定结果显示在感染后期病毒诱导的PTEN基因表达上调对于维持宿主出现临死前爬行至高处的异常行为，即“树顶病”典型现象有着重要作用，对于维持宿主存活时间造成宿主感染病毒后龄期延长有一定作用，对于病毒成功实现复制大量亦有重要作用。 综上所述，舞毒蛾幼虫受到核型多角体病毒感染后在转录和代谢方面均发生较大变化，其中PI3K/AKT信号通路在病毒操控宿主行为变化方面可能发挥作用。同时，PTEN基因在舞毒蛾核型多角体病毒与宿主之间相互作用中发挥了重要功能。这些研究发现为最终完全阐明“树顶病”的形成提供了重要的科学依据。
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