摘要
骨骼肌作为人体最大的分泌组织，协调机体功能，其结构由多个不同理化和代谢上不同的纤维类型组成。不同类型的肌纤维对骨骼肌生理状态及肉品质有重要意义，肌纤维类型的分型与转化受复杂的调控网络影响，其中环状RNA(circularRNAcircRNA)在此过程中扮演重要角色。CircNEB在肌肉组织中高表达，在成肌细胞增殖分化与小鼠骨骼肌肌纤维类型转化过程中具有重要的作用。RT-qPCR结果显示circNEB在小鼠不同肌肉组织中表达有差异。因此，本研究以C2C12成肌细胞、C57BL/6J小鼠为研究材料，探究CircNEB对肌纤维类型转化的调控作用及其下游ceRNA机制。 本文首先通过在circAtlas上筛选出骨骼肌中高表达的circNEB，在小鼠C2C12成肌细胞系中干扰circNEB，检测成肌细胞增殖、分化及肌纤维类型的变化；随后构建抑制circNEB的腺相关病毒，注射于1月龄小鼠胫骨前肌，检测小鼠体况、运动能力、肌纤维横截面积、肌纤维类型转化；最后探究circNEB调控肌纤维类型转化靶定的miRNA及下游靶基因获得主要结果如下: 1.干扰circNEB促进C2C12成肌细胞增殖、分化。CircNEB在骨骼肌组织中高表达；在小鼠C2C12成肌细胞中用siRNA抑制circNEB的表达，与对照组相比，试验组细胞增殖相关基因PCNA、cyclinD1、cyclinE和分化相关基因MyOD、MyOG、MyHC的mRNA水平及蛋白水平显著提升(P＜0.05)。 2.干扰circNEB促进C2C12成肌细胞内快肌肌管的形成。通过干扰circNEB在小鼠C2C12成肌细胞中的表达，快速收缩型肌纤维标志基因Tnni2、Tnnt3及相关蛋白的表达水平极显著增加(P＜0.01)；慢速收缩型肌纤维标志基因Tnni1、Tnnt1及相关蛋白的表达水平显著降低(P＜0.01)。 3.小鼠骨骼肌干扰circNEB不影响小鼠正常的生理状况，但改变了小鼠胫骨前肌肌纤维类型。构建肌肉特异性干扰circNEB的腺相关病毒载体，肌肉多点注射一月龄小鼠。试验组小鼠体重以及肌肉、脂肪、肝脏和心脏占体重的比例与对照组相比均无明显差异(P＞0.05)；小鼠强迫游泳实验结果显示试验组小鼠耐力运动的时长相较于对照组显著降低(P＜0.05)；检测小鼠胫骨前肌中不同肌纤维类型相关基因和蛋白表达水平，结果显示试验组慢收缩肌相关基因的mRNA水平和蛋白水平显著下降(P＜0.05)，快收缩肌相关基因的mRNA水平和蛋白水平显著上升(P＜0.05)；HE染色结果显示对照组中肌纤维面积显著小于试验组中肌纤维面积(P＜0.05)。 4.预测并验证circNEB通过miR-6538/AMPK信号通路在C2C12细胞中促进慢速型肌管类型形成。通过CircMir软件在线预测circNEB靶定的miRNA为miR-6538，通过RNAhybrid检验二者结合情况，预测结果显示二者结合紧密；通过双荧光素酶活性检测试验，发现试验组可以极显著降低荧光素酶活性(P＜0.01)；通过在小鼠C2C12成肌细胞中过表达miR-6538，快速收缩型肌纤维标志基因Tnni2、Tnnt3及相关蛋白表达水平显著增加(P＜0.05)；慢速收缩型肌纤维标志基因Tnni1、Tnnt1的mRNA水平及相关蛋白水平显著降低(P＜0.05)；P-AMPK/SIRT1/PGC-1α蛋白水平显著降低(P＜0.05)。 综上所述，circNEB在骨骼肌中高表达；circNEB可以促进C2C12成肌细胞增殖、肌原分化与快速型肌管的形成，同时circNEB在小鼠体内调控肌纤维类型的转化，并影响骨骼肌肌纤维横截面积和运动表现。研究结果丰富了调控肌原发生与肌纤维类型转化相关的circRNA调控网络，也为改良肉品质提供理论支持。
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