摘要
植物病毒的基因组较小，只能编码少量蛋白质，因此必须“招募”寄主因子才能在受侵染的细胞中存活和复制。真核翻译延伸因子1A（eukaryotictranslationelongationfactor1A，eEF1A）是真核生物蛋白质翻译延伸的关键因子。eEF1A在各物种中高度保守，其已被证明可以调节多种植物RNA病毒的复制过程。中国小麦花叶病毒（Chinesewheatmosaicvirus，CWMV）和小麦黄花叶病毒（Wheatyellowmosaicvirus，WYMV）的基因组都是由两条正义RNA链组成，这两条RNA链对病毒的复制和翻译都至关重要。CWMV和WYMV的分子生物学研究已经取得了一些进展，但是关于寄主因子参与CWMV、WYMV或其他小麦土传病毒侵染过程的研究还较少。为了揭示寄主因子在小麦土传病毒侵染中的分子机制，本研究针对寄主因子eEF1A参与CWMV和WYMV的侵染过程进行研究，并通过一系列证据证明eEF1A是CWMV和WYMV成功侵染的重要寄主因子。主要研究结果如下： 1.CWMV和WYMV侵染小麦（Triticumaestivum，Ta）与本氏烟（Nicotianabenthamiana，Nb）植株后可以诱导eEF1A上调表达。通过对多个物种中的eEF1A进行同源性分析，发现其氨基酸序列相似性高达98%，表明该蛋白在各物种中高度保守，据此推测其功能也是保守的。通过qRT-PCR、Westernblot和Northernblot实验，对CWMV侵染7-28dpi（dayspostinoculation）的本氏烟分别取样后进行分析，结果显示病毒在mRNA水平、蛋白质水平和基因组RNA的积累量与eEF1A的表达量都随着CWMV侵染时间的延长而增加。 2.利用烟草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRV）诱导的基因沉默（Virusinducedgenesilencing，VIGS）方法对本氏烟中的eEF1A进行沉默后再接种CWMV/WYMV。使用qRT-PCR、Westernblot和Northernblot实验检测eEF1A沉默植株中CWMV的增殖水平，结果显示CWMV的mRNA水平、蛋白质水平、基因组RNA的积累、复制水平和CP蛋白的翻译水平都显著下调，而在本氏烟中瞬时过表达eEF1A的结果则与之相反；eEF1A沉默植株中的WYMV蛋白积累量下调，而NbeEF1A瞬时过表达后则增强WYMV蛋白质的积累。以上结果均表明NbeEF1A正调控CWMV和WYMV的积累。 3.我们首先在体内和体外验证了eEF1A与CWMV的复制相关蛋白不发生蛋白质-蛋白质的相互作用，随后利用凝胶迁移或电泳迁移率实验（Electrophoreticmobility-shiftassay,EMSA）对eEF1A与CWMV基因组RNA的相互作用进行分析，结果显示eEF1A与CWMV基因组RNA1和RNA2的（-）3''-UTR（Untranslatedregion）、（+/-）5''-UTR、以及随机选取的RNA1的（+/–）301-781nt和RNA2的（+/–）681-981nt均未发生结合，只有CWMVRNA1和RNA2的（+）3''-UTR特异性结合eEF1A。 4.通过微量热泳动实验（Microscalethermophoresis,MST）验证eEF1A与CWMVRNA1/RNA23''-UTR各部分的亲和力，结果显示eEF1A与3''-UTR结合的关键区域位于C-端TLS（tRNA-likestructure）结构域（RNA1：6988-7147nt，RNA2：3407-3569nt）。为了明确该区域在CWMV侵染过程中的作用，我们构建了CWMVRNA1和RNA2的TLS缺失突变体：CWMVΔR1，CWMVΔR2。与野生型CWMV和CK植株相比，CWMVΔR1与CWMVΔR2侵染植株的蛋白质水平、基因组RNA的积累、复制水平和CP蛋白的翻译水平都呈现了不同程度的下调，感病植株的症状也明显减轻，其中CWMVΔR1侵染植株的蛋白质水平和基因组RNA的积累几乎丧失，症状也更接近CK植株。以上结果表明，CWMV3''-UTR的TLS是结合eEF1A和CWMV成功侵染的重要区域。 5.对CWMV3''-UTR的C-端保守区域进行RNA的二级结构预测发现其存在一个类三叶草结构（tRNA-likestructure,TLS），该TLS由6个SL（stem-loop）组成。为了明确eEF1A与CWMV3''-UTR结合力的关键结构域，我们针对这6个SL制备了相应的缺失突变转录本：ΔSL-1、ΔSL-2、ΔSL-3、ΔSL-4、ΔSL-5、ΔSL-6。利用EMSA与MST技术对其结合活性分别进行分析，结果均显示eEF1A与CWMVRNA23''-UTR结合的关键区域为SL-6。进一步针对SL-6构建互补突变体3''-UTRIns(auguuca)、缺失突变体m3''-UTRΔ3561-3567和突变体m3''-UTRugaacau发现，相对于野生型CWMV，突变体m3''-UTRΔ3561-3567和m3''-UTRugaacau在病毒积累量、复制水平和翻译效率均显著下调，而互补突变体则接近于野生型CWMV水平。综上所述，CWMV3''-UTR的SL-6结构突变后干扰了其与eEF1A结合的能力，从而导致病毒侵染力下降。
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