摘要
葡萄是世界性重要经济果树。欧亚种葡萄具有优良的商品价值，在世界范围内被广泛种植，但其抗病性差，易遭受白粉病等病害的侵害，对果实品质及产量造成严重的损失。化学防治虽具有见效快等优点，但也易使植物产生抗药性且污染环境。因此研究可用于抗病育种的抗病基因对解决葡萄病害问题具有重要意义。本研究依据前人抗病基因研究基础，选取了芪合酶基因STS6、STS29、泛素连接酶基因PUB23、PUB24和病程蛋白相关基因PR1、PR10.1六个抗病相关基因，设计引物，在人工接种白粉菌条件下，对抗病的中国野生毛葡萄丹凤-2和感病的欧亚种葡萄‘赤霞珠’通过实时荧光定量检测六个抗病相关基因的抗病性表达，从中筛选出中国野生毛葡萄丹凤-2基因VqPR1对白粉病的差异性表达，通过同源克隆VqPR1并研究其抗病功能。主要研究结果如下： 1、同源克隆获得病程相关蛋白VqPR1基因，序列全长为483bp，编码160个氨基酸，定位于3号染色体，等电点为8.04，为碱性氨基酸，含有PR1家族特征结构域；在自然条件下，对中国野生毛葡萄丹凤-2的不同组织表达分析，VqPR1基因在果实和花序器官中呈特异性高表达；通过PEG介导的方法将重组载体质粒转入拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析，结果表明，VqPR1-GFP荧光在液泡区域成弥散状分布。 2、通过酵母双杂交实验和BIFC实验验证了VqPR1与泛素连接酶VqPUB24和胞泌复合体亚基VqEXO70B1都存在相互作用。通过烟草瞬时表达系统进行VqPR1-GFP蛋白和自噬体标记物AtATG8f-mCherry的共定位试验，结果表明VqEXO70B1和VqPR1均能与自噬体共定位，并且VqPR1也能与液泡膜Marker共定位，表明VqPR1蛋白与VqEXO70B1蛋白互作定位于自噬体膜上。通过互作初步验证了VqPR1可能是通过参与调控细胞内自噬这一重要的过程来发挥抗病功能。 3、通过农杆菌介导的花序侵染法稳定转化拟南芥，并筛选获得VqPR1过量表达的拟南芥株系。人工接种白粉菌观察拟南芥叶片抗病表型，接种白粉菌7d天后，野生型拟南芥叶片感病面积明显大于VqPR1过表达株系。台盼蓝染色观察发现，过表达拟南芥株系菌丝发育进程较慢，并且过表达拟南芥株系能够积累更多的胼胝质抵御病原菌的侵害。以上结果说明，过量表达VqPR1基因能够增强拟南芥叶片对白粉菌的抗性。通过荧光实时定量PCR分析SA途径相关基因和活性氧生成基因的表达量，VqPR1基因过量表达显著下调上述相关基因的表达，并且在抗白粉菌过程中响应幅度较低，表明VqPR1过量表达能负调控SA信号途径和活性氧的积累，这种负调控机制可能是为了抑制持续的免疫反应对植物造成伤害。
NETL