摘要
杨树（Populus）作为重要的用材和造林树种，广泛应用于造纸、家具工业和生物能源。杨树的地上部分生长快，对水分的需求量大，而中国西北干旱和半干旱地区水分匮乏，杨树的生长发育受到了严重抑制，干旱已成为影响其可持续发展的一个重要因素。脯氨酸的积累常常在植物应对干旱等渗透胁迫时出现，以缓解胁迫带给植物的损害。P5CS作为编码脯氨酸合成关键酶的基因，具有较大的研究价值。 本研究在白杨派杨树优良品种84K杨（Populus alba×P.glandulosa）中克隆脯氨酸合成代谢的关键限速酶基因-P5CS1基因，分析了其时空表达模式及干旱胁迫响应特征；以银中杨（Populus alba×P.Berolinensis）为遗传转化受体进行了P5CS1基因的超表达、抑制表达遗传转化，从表型、分子和生理水平上对P5CS1基因的抗旱功能进行了鉴定。主要结果如下： 1．84K杨P5CS1基因克隆分析表明，PagP5CS1开放阅读框为2160bp，由719个氨基酸编码组成。在现有的毛果杨数据库中，通过生物信息学分析，预测PtP5CS1和PtP5CS2均为不含信号肽的非跨膜的亲水性蛋白。系统发育结果表明，PtP5CS1和PtP5CS2蛋白在植物进化中高度保守。启动子元件分析显示PtP5CS1和PtP5CS2蛋白中含有大量的顺式作用元件，表明P5CS在杨树耐受干旱等非生物胁迫中有重要作用。 2．通过荧光定量PCR试验测定银中杨脯氨酸合成代谢基因PaP5CS1、PaP5CS2和PaOAT表达水平，结果表明，随着干旱时间的增加，它们的表达量逐渐上升，故杨树脯氨酸合成代谢基因P5CS1、P5CS2和OAT在应对干旱胁迫时的调控中具有一定功能。P5CS1、P5CS2和OAT基因在杨树的根、茎、叶中均有表达，其中P5CS1和P5CS2基因在杨树叶片中表达水平最高，在茎干中表达水平最低；OAT基因在杨树叶片中表达水平最高，在根中表达水平最低。 3．构建了PagP5CS1超表达载体，并根据农杆菌介导法转化银中杨叶片，成功获得12个PagP5CS1超表达转基因杨树株系，其中P5CS1基因表达量最高的杨树株系为野生型表达量的8.3倍。 4．经过干旱胁迫处理，相对于野生型，超表达株系叶片萎蔫程度更低；在干旱胁迫下，超表达株系中P5CS1基因表达量和脯氨酸含量均高于野生型，说明P5CS1超表达增强了杨树的耐旱性，P5CS1基因在干旱胁迫下发挥了正向调控作用。 综上所述，杨树P5CS1基因对干旱胁迫高度响应，PagP5CS1对干旱胁迫下杨树游离脯氨酸的合成、积累具有关键作用，超表达杨树会通过增加脯氨酸积累来增强杨树的耐干旱能力。
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