摘要
茯苓作为一种具有多种药用功效的药用真菌，在东亚地区被广泛使用。2000多年前问世的《神农本草经》便将茯苓列为中药中的上品，其以干燥菌核入药，具有健脾胃、祛湿、镇静安神、利尿的作用。茯苓酸(Pachymic acid，PA)是茯苓中一种羊毛甾烷型三萜化合物，是其最重要的药效成分，也是对茯苓进行质量评价、质量控制和配方研究的重要指标。药理学研究表明，PA具有镇静、降血糖、消炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。茯苓栽培大多以松木为栽培材料，但由于制药业对茯苓需求的不断增长，导致森林资源大幅减少，而通过茯苓菌丝采用固体或液体发酵生产PA是一种很有潜力的替代方法，具有产量高，耗时短，经济价值高的优点，而且茯苓在液体发酵过程中可以积累更多的三萜类成分。目前有许多关于茯苓液体发酵的报道，但是茯苓液体发酵中菌丝生物量和PA产量的关系以及菌丝的最佳生长条件并没有得到很好的论证。同时，关于PA生物合成的分子机制尚不清楚。本研究采用反应曲面法(RSM)探究菌丝生物量、茯苓酸含量和茯苓酸总产量的关系，优化了茯苓菌丝的发酵条件，筛选了茯苓菌丝的发酵培养基。此外，在优化的液体发酵条件下，利用RT-PCR技术定量检测了部分基因的表达水平，以期找出茯苓菌丝生长调控和茯苓酸生物合成的实际机制。本研究提高了我们对优化条件下菌丝体生长和茯苓酸生物合成相关基因的认识，并为进一步研究两个表达量高的基因(GH16和SQE)功能提供了线索。本研究以优化的液体发酵方案培养的菌丝体和菌核可以作为茯苓大规模培养的种质资源。并为PDB液体培养基上生产茯苓酸提供了一种新的有效途径。具体结果如下： 1.采用单因素试验对菌丝生长发酵条件进行初步筛选，得到菌丝生长发酵的最佳培养条件为：接种孢子浓度为10%，培养基初始pH为5，温度28℃，转速为180rpm，发酵瓶容量对菌丝生长没有显著影响。 2.利用葡萄糖，蔗糖，乳糖和麦芽糖确定PDB和合成培养基中菌丝生长的最佳碳源，结果表明在两种培养基中使用蔗糖可获得最大的菌丝产量。利用尿素，硫酸铵，蛋白胨，酵母提取物和天冬酰胺确定最佳氮源，结果表明蛋白胨在PDB培养基中最有益于茯苓菌丝生长，而天冬酰胺在合成培养基中的利用率最高。 3.实验结果表明，茯苓菌丝的最佳培养条件为:蔗糖浓度27.51g/L，蛋白胨浓度47.35g/L，初始pH值为5.2。在优化的发酵条件下，菌丝生物生长量最大值为6.68g/L。液体发酵生产茯苓酸的最佳条件为：蔗糖浓度为15.41g/L，蛋白胨浓度为29.84g/L，初始pH为4。在优化的生长条件下，最大茯苓酸产量为1.25mg/g。在PDB培养基上，茯苓酸总产量最高的理想条件为:蔗糖浓度14.90g/L，蛋白胨浓度33.90g/L，初始pH为4.7，在优化的生长条件下，茯苓酸总产量最高为4.76g/L。 4.SQE，HMGR，SOAT和SMT-1等四个基因被认为参与了茯苓酸的生物合成，其中SQE在优化条件下表达良好。与菌丝生物量相关的碳水化合物活性酶（CAZymes）基因中（GH47，GH47-2，GH12和GH16），GH16酶家族在优化条件下的表达高于其他基因。
NETL