马钱子与苏木有效组分配伍对RA血瘀证大鼠Wnt5a/PKC/NF-κB信号通路的干预机制研究

李茜¹

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作者信息

1. 山东中医药大学
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摘要

研究目的：建立RA血瘀证病证结合动物模型，通过体内外实验，探讨Wnt5a/PKC/NF-κB信号通路在RA发病中的意义，观察马钱子与苏木有效组分配伍（简称马苏组分配伍）对Wnt5a/PKC/NF-κB信号通路的调节，阐明其发挥抑制炎症反应、减轻血管内皮损伤及延缓关节软骨退变作用的可能机制，寻找治疗RA的新靶点。研究方法：在胶原诱导型关节炎模型（CIA）的基础上，复合盐酸肾上腺素注射液与冷水应激相结合的方法建立RA血瘀证大鼠模型，并观察马苏组分配伍对模型大鼠的一般状态、足趾肿胀度、关节炎指数、膝关节软骨病理组织学的影响；采用酶联免疫吸附法（Elisa）检测RA血瘀证模型大鼠外周血各炎性因子TNF-α、IL-1α、VEGF、COX-2、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-15、VCAM-1、ICAM-1的浓度水平；免疫组织化学法（IHC）检测大鼠膝关节软骨组织中Wnt5a/PKC/NF-κB信号通路上的关键蛋白Wnt5a、PKC及其下游因子TNF-α、VCAM-1、VEGF的表达情况；蛋白质印迹法（Westernblot）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测含药血清干预48h后，RA血瘀证模型大鼠膝关节软细胞Wnt5a/PKC/NF-κB信号通路上的关键因子Wnt5a、PKC、NF-κBp65蛋白及mRNA的表达，及其下游因子VCAM-1、COX-2mRNA的表达；从细胞、蛋白及基因3个层面揭示马苏有效组分配伍对RA血瘀证治疗的作用机理。研究结果： 1.一般药效学结果显示：造模后大鼠一般状态欠佳，足趾肿胀度显著加重（P＜0.01）；关节炎指数显著升高（P＜0.01）；膝关节软骨组织病理切片可见关节软骨表面不光整，软骨全层细胞减少，细胞排列紊乱，部分软骨陷窝消失，软骨基质染色不均匀，潮线模糊、不规则，软骨病理评分显著增高（P＜0.01）。经治疗3wk后，各给药组各项观测指标与模型组比较均有不同程度的改善，表现为一般状态改善，足趾肿胀度显著减轻（P＜0.05或0.01），关节炎指数显著下降（P＜0.05或0.01），膝关节软骨组织病理切片可见给药组大鼠关节软骨的病理损伤均有不同程度的减轻，软骨组织病理评分显著降低（P＜0.05或0.01）。Elisa检测血清中的相关炎性因子显示：模型组各指标均显著升高（P＜0.01），各给药组均可不同程度的降低模型大鼠血清中各炎性因子的水平。其中，马苏有效组分1∶6配伍组对于减轻RA血瘀证的炎症和血管内皮损伤、抑制软骨的血管化、延缓软骨退化的作用与MTX组疗效基本相当，马苏1∶18组分配伍组疗效不及MTX组，而马、苏单组分组疗效欠佳。 2.免疫组化检测结果显示：模型组Wnt5a、PKC及其下游因子TNF-α、VCAM-1、VEGF的表达均显著升高（P＜0.05或0.01），给药治疗后，给药组各蛋白表达均有不同程度的降低，其中马苏组分配伍1∶6组AOD值与MTX组无明显差异，各蛋白表达显著下降（P＜0.05或0.01），提示马苏1∶6组分配伍组可能通过抑制RA血瘀证模型大鼠软骨细胞中Wnt5a/PKC信号通路上的关键蛋白Wnt5a、PKC及其下游因子TNF-α、VEGF、VCAM-1的病理性升高表达，从而达到减轻炎症对软骨的侵蚀破坏、抑制软骨血管化、延缓软骨退化的作用，这可能是其发挥治疗作用的一个重要机制。 3.分离培养膝关节软骨细胞，从软骨细胞的形态学、细胞增殖能力来看，第2代细胞生长良好。RA血瘀证模型大鼠膝关节软骨细胞第2、4代均比正常大鼠关节软骨细胞增殖速度慢（P＜0.05），生物学特性明显，符合软骨细胞退变的表现。所以可选用第2代RA血瘀证模型大鼠软骨细胞用于体外实验。 4.以含药血清干预RA血瘀证模型大鼠第2代软骨细胞，结果显示空白血清组及不同浓度的马苏血清组、西药组均使软骨细胞大量增殖（P＜0.01）。相同浓度下马苏1∶6血清组和西药组比较无明显差异，西药组与5%马苏血清组比较，显著促进软骨细胞的增殖（P＜0.05或0.01），10％马苏血清组与20％马苏血清组比较无明显差异。3个浓度的马苏血清组，以20%血清组对软骨细胞的增殖作用最为明显；干预24h、48h及72h不同时间点比较，48h作用最明显。 5.通过Westernblot检测软骨细胞中Wnt5a、PKC、NF-κBp65、VCAM-1蛋白的表达，结果显示，与模型组比较，西药组、20%血清组和10%血清组模型大鼠膝关节软骨细胞中Wnt5a、PKC、NF-κBp65、VCAM-1蛋白表达显著降低（P＜0.05或0.01）；5%血清组PKC蛋白表达显著降低（P＜0.05），Wnt5a、NF-κBp65、VCAM-1有降低趋势，但与模型组比较差异不明显。组间比较，20%血清组Wnt5a、PKC、NF-κBp65、VCAM-1表达与西药组无明显差异；5%血清组Wnt5a、PKC、NF-κBp65、VCAM-1的表达较西药组显著升高（P＜0.05或0.01），较10%血清组PKC、NF-κBp65、VCAM-1表达显著升高（P＜0.05）；10%血清组PKC、VCAM-1的表达较西药组显著升高（P＜0.05）；20%血清组较10%血清组NF-κBp65、VCAM-1的表达显著降低（P＜0.05）。不同浓度的马苏含药血清的作用效果在PKC、Wnt5a、NF-κBp65、VCAM-1蛋白的表达中呈现出一定的量效关系。 6.通过RT-qPCR检测软骨细胞中Wnt5a、PKC、NF-κBp65、COX-2的mRNA的表达，结果显示，与模型组比较，西药组、20%血清组和10%血清组RA血瘀证模型大鼠膝关节软骨细胞中Wnt5a、PKC、NF-κBp65、COX-2基因的表达均显著降低（P＜0.05或0.01），5%血清组PKC、COX-2基因表达显著降低（P＜0.05），Wnt5a、NF-κBp65mRNA表达有降低趋势，但与模型组比较差异不明显。组间比较，20%血清组Wnt5a、PKC、NF-κBp65、COX-2mRNA表达与西药组无明显差异；5%血清组Wnt5a、PKC、NF-κBp65、COX-2mRNA的表达较西药组显著升高（P＜0.05或0.01），较10%血清组Wnt5a、NF-κBp65mRNA表达显著升高（P＜0.05）；10%血清组PKC、NF-κBp65、COX-2mRNA的表达较西药组显著升高（P＜0.05）；20%血清组较10%血清组NF-κBp65、COX-2mRNA的表达显著降低（P＜0.05）。3组不同浓度的马苏血清的作用效果在PKC、Wnt5a、NF-κBp65、COX-2mRNA的表达中呈现出一定的量效关系。研究结论： 1.马苏有效组分配伍能显著降低RA血瘀证大鼠外周血炎性因子水平，减轻关节肿胀及软骨组织的血管化，抑制炎症反应对血管内皮的损伤，延缓关节软骨的退变，其中马苏1∶6组分配伍组疗效更为显著。 2.采用单纯Ⅱ型胶原酶消化软骨组织分离培养得到的细胞活性良好，RA血瘀证模型软骨细胞符合软骨细胞退变的生物学表现，可以第2代细胞作为体外实验的研究基础。 3.以不同浓度的马苏组分配伍含药血清对RA血瘀证模型大鼠膝关节软骨细胞进行干预，得出干预48h对细胞的增殖作用最为明显。 4.马苏组分配伍含药血清能够有效抑制Wnt5a/PKC/NF-κB信号通路中关键的信号传导分子Wnt5a、PKC、NF-κBp65蛋白及基因的过度表达，减少下游因子VCAM-1、TNF-α、VEGF蛋白及COX-2mRNA的表达，减轻炎症对关节软骨的破坏和侵蚀，延缓关节软骨的退化以保护关节软骨，提示通过调节Wnt5a/PKC/NF-κB信号通路的相关因子的表达可能是马苏有效组分配伍发挥作用的主要机制之一。 5.20%马苏含药血清在阻止Wnt5a/PKC/NF-κB信号通路关键细胞因子的信号传递、抑制RA血瘀证模型大鼠关节软骨的退化方面，明显优于其他浓度组，该浓度是较为适宜的血药浓度。

关键词

类风湿性关节炎血瘀证/马钱子/苏木/有效组分配伍/Wnt5a蛋白/PKC蛋白/转录因子-κB/调控机制

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授予学位

博士

学科专业

中药学

导师

唐迎雪

学位年度

2017

学位授予单位

山东中医药大学

语种

中文

中图分类号

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