摘要
CRISPR基因编辑工具的衍生技术迅速在生命科学、生物医学以及动植物育种领域得到应用。基于基因编辑技术的新兴分子设计育种可以达到快速改良动物在育种的目的。同源重组修复（homology-directed repair，HDR）是基因敲入和精确编辑的重要策略，但是其编辑效率仍然有待提高。基于将供体DNA驱动富集至双链断裂处（double-stranded break，DSB）的思路，已有几套CRISPR/Cas9衍生系统被报道用于提高HD R的基因编辑效率。本文使用供体适配系统（Donor Adapting System，DAS）一词来概括那些用适配子修饰CRISPR/Cas9系统以达到驱动与适配接头融合连接的供体DNA的基因编辑策略。同时设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配系统，将酵母Gal4蛋白中的DNA结合域与Cas9蛋白进行融合表达，利用PCR设计在双链DNA供体上添加与其特异性结合的序列（Binding Sequence，BS）,使其能够与Cas9-Gal4BD融合蛋白进行结合同时在DBS处募集达到较高的有效浓度，从而提高HDR效率的一套编辑系统。并对CRISPR/Cas9-Gal4BD系统的融合设计和供体进行优化验证，并使用优化后的系统在基因组上进行精确编辑。 本研究的主要结果如下： 1.使用重组DNA技术构建了CRISPR/Cas9-GGS1-Gal4BD、CRISPR/Cas9-GGS3-Gal4BD、CRISPR/Cas9-GGS5-Gal4BD等主要表达载体及其相关报告载体。 2.将酵母转录因子Gal4的DNA结合域（Gal4BD）和能够特异性的识别并结合的特异性结合序列（Binding Sequence，BS）引入CIRSPR/Cas9系统及双链DNA（ds DNA）供体。构建CIRSPR/Cas9-Gal4BD供体适配系统。 3.通过SSA活性报告试验对CIRSPR/Cas9-Gal4BD融合方式进行优化设计试验，获得以GGS5（5个重复GGS序列）作为连接linker同时Gal4BD蛋白融合在Cas9蛋白C端的融合对Cas9蛋白活性和表达影响最小。 4.通过HDR效率报告试验进一步对BS-dsDNA供体进行优化设计试验，发现单个BS序列添加在PCR双链供体的5’端的BS-dsDNA供体设计方案的HDR效率比其他设计高出20~60%。 5.使用优化后的Cas9-Gal4BD融合表达方案和BS-dsDNA供体设计方案对HEK293T细胞基因组进行精确编辑。在选择的四个基因位点（AAVS1,EMX1.NUDT5,VEGFA）上进行编辑后的结果显示，有三个基因位点的HDR编辑的效率提高了20%同时发现本系统对CRISPR/Cas9系统的脱靶效应具有抑制作用。
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