摘要
视网膜色素变性（Retinal pigmentosa，RP）是一种进行性遗传性视网膜变性疾病，临床主要表现为自幼出现的夜盲和进行性视野缩窄，全球患病率约为1/3000–1/7000[1]。RP的病理机制被认为是由原发性遗传缺陷或继发于视网膜色素上皮细胞变性导致的光感受器的进行性凋亡[2-4]。目前，RP尚无有效的治疗方法。最近研究认为RP是一种慢性炎症性疾病，炎症因子和免疫调控过程在疾病的进展中起着重要作用[5]，为RP的治疗提供了新的思路和方向。 然而，最近有研究表明，间充质干细胞经血管移植可能引起不同程度的血管栓塞，并且绝大部分输注的细胞都被肺毛细血管阻塞，导致肺毛细血管栓塞等严重并发症，增加了静脉移植的风险。严重威胁着受试者的安全[20-22]。虽然发生血管栓塞的机制还未明确，但细胞直径的大小被认为是导致血管栓塞的关键因素，即直径小的MSC通过肺毛细血管的能力更强，而直径较大的MSC更容易引起肺血管栓塞[23]。尽管前期表明，MSCs静脉移植未观察到明显不良反应及副作用，但随着接受治疗的患者数量及范围的扩大，以及重复治疗次数的增加，静脉移植MSCs也存在发生肺毛细血管阻塞的潜在风险。因此，需进一步优化治疗方案，以提高MSCs静脉移植的安全性。 目前而言，MSCs的作用机制一方面来自MSCs的旁分泌效应介导的免疫调节和神经营养作用[24-26]；另一方面则认为是细胞迁移到靶器官后增殖分化，从而修复、替代受损的组织[27,28]。然而，越来越多的证据表明绝大多数静脉输注的MSCs在早期被阻塞在肺上，不能有效到达靶器官[20,22]。因此，旁分泌效应被认为可能是MSCs静脉移植治疗视网膜疾病的主要机制[29]。 因此，基于本实验室前期研究基础，假设：静脉移植人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）治疗视网膜色素变性是安全、有效的；并且直径小的hUCMSCs（直径＜20μm）能够进一步提高静脉移植的安全性，同时发挥与hUCMSCs相似的对视网膜的保护作用，而其主要机制为通过旁分泌效应介导的免疫调节和神经营养作用。 本研究包括两部分： 第一部分：hUCMSCs静脉移植治疗晚期视网膜色素变性患者的安全性和有效性研究 1.本研究通过了陆军军医大学第一附属医院伦理委员会批准（批件号：2014年科研第44号）。根据纳入、排除标准，纳入32例晚期RP患者。 2.完成移植前评估后，32例受试者均接受hUCMSCs静脉移植，输注细胞量为1×108cells。随访12个月期间，无一例受试者发生局部或全身不良反应。大多数患者在治疗后3个月最佳矫正视力（Best corrected visual acuity,BCVA）得到了提高。在随访的第1、2、3、6、9、12个月，BCVA改善或维持的比例分别为96.9%、95.3%、93.8%、95.4%、90.6%和90.6%。81.3%的患者治疗后视力持续得到维持或提高直到治疗后的12个月。受试者视功能相关生命质量量表-25（National Eye Institute25-Item Visual Function Questionnaire,NEI_VQF-25）的平均得分在第3个月时显著提高，平均视野敏感度和闪光视觉诱发电位（Flash visual evoked potential，FVEP）在移植后较稳定，无明显改变，提示hUCMSCs静脉移植治疗晚期RP患者是安全的，治疗后3个月患者生活质量明显改善，并且大多数患者的视觉功能在长期内（12个月）得到改善或维持。 第二部分：直径＜20μm的hUCMSCs静脉移植治疗RCS大鼠的安全性和有效性研究 1.使用CellTrics?10μm（希森美康，日本）尼龙细胞滤器对hUCMSCs进行过滤，得到直径小的hUCMSCs（Small hUCMSCs，S-hUCMSCs），并测得其平均直径为8.636±2.256μm，并且最大直径＜20μm。通过比较发现，S-hUCMSCs和hUCMSCs表达相同的表面抗原，在相应培养基诱导下，均能够向成脂、成骨和成软骨方向进行分化。转录组测序显示S-hUCMSCs和hUCMSCs的基因表达谱相似，表明这两种细胞是同一类间充质干细胞。细胞周期检测显示S-hUCMSCs的增殖指数（Proliferation index，PI）比hUCMSCs更高，提示处于S期和G2/M期的S-hUCMSCs更多，表现出更强的增殖能力。 2.用携带绿色荧光蛋白（Green gluorescent protein，GFP）的慢病毒转染hUCMSCs后，通过10μm尼龙细胞滤器分选得到S-hUCMSCs。选用RCS大鼠作为视网膜变性动物模型，尾静脉分别移植1×106个S-hUCMSCs和hUCMSCs后1h，两组大鼠的肺上均可见大量GFP阳性的细胞。移植后12h和24h，肺组织中GFP阳性的S-hUCMSCs数量明显少于hUCMSCs。移植后48h，S-hUCMSC组的肺组织上只观察零星的GFP阳性细胞，hUCMSC组肺上的细胞较之前减少，但仍多于S-hUCMSC组。移植后72h，各实验组肺上均未再发现GPF阳性的细胞。结果提示在S-hUCMSCs静脉移植降低了移植细胞在肺上被阻塞的风险，提高了治疗的安全性。此外，在移植后的各时间点，RCS大鼠的视网膜铺片上均未发现GFP阳性的细胞，表明尾静脉移植的S-hUCMSCs和hUCMSCs未归巢到视网膜。 3.采用出生后30天的RCS大鼠，通过尾静脉分别移植1×106个S-hUCMSCs和hUCMSCs，并以PBS注射和未行任何处理的RCS大鼠作为对照。移植后7d，闪光视网膜电图（Flash flectroretinogram，FERG）检查显示S-hUCMSC组和hUCMSC组的b波幅值/潜时（Amplitude/latency，A/L）的比值明显高于对照组。移植后7d和14d，移植组的视网膜外核层（Outer nuclear layer，ONL）细胞变性丢失的速度明显减缓，其厚度比PBS组和未处理组更厚，表明S-hUCMSCs和hUCMSCs能够延缓视网膜变性，保护视功能。移植后7d，S-hUCMSC组和hUCMSC组大鼠血清中白介素-6（Interleukin-6，IL-6）的水平显著低于对照组，白介素-10（Interleukin-6，IL-10）的水平在7d和14d有升高趋势，脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、睫状神经因子（Ciliary neurotrophic factor，CTNF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）的水平在移植后14d和28d明显上调，但S-hUCMSCs组和hUCMSCs组之间无明显差异。提示S-hUCMSCs和hUCMSCs通过调节炎症因子和神经营养因子的表达水平，对视功能和光感受器发挥了相似的保护作用。 4.小胶质细胞是视网膜的主要免疫细胞，用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）激活BV2小胶质细胞24h后，将接种了S-hUCMSCs和hUCMSCs的Transwell小室分别悬挂在培养小胶质细胞的6孔板上，建立Transwell间接共培养体系。同时设立对照组，即仅行LPS处理和未行任何处理的BV2小胶质细胞。各实验组分别在体外培养12h、24h和48h。TUNEL细胞凋亡染色观察到，与S-hUCMSCs和hUCMSCs分别共培养24h和48h后，小胶质细胞凋亡的比例明显高于LPS组和未处理组。同时，通过ELISA法检测共培养上清中炎症因子的表达水平，结果表明与S-hUCMSCs和hUCMSCs共培养24h和48h的小胶质细胞分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α水平较LPS组明显下降，提示S-hUCMSCs与hUCMSCs一样，能够通过旁分泌作用促进小胶质细胞凋亡，抑制小胶质细胞分泌炎症因子,但S-hUCMSCs组和hUCMSCs组之间无明显差异。 根据以上结果，本研究得出以下结论： 1.hUCMSCs静脉移植治疗晚期RP是安全的，无任何全身不良反应和并发症。 2.hUCMSCs静脉移植后3个月患者生活质量明显改善，直到治疗后12个月81.3%的患者视功能仍得到改善或维持。 3.直径＜20μm的S-hUCMSCs与hUCMSCs生物学特性相似，并且S-hUCMSCs表现出更强的增殖能力。 4.S-hUCMSCs在RCS大鼠尾静脉移植后，在肺上被阻塞的细胞量明显少于hUCMSCs，降低了血管栓塞的风险，提高了治疗的安全性；同时S-hUCMSCs与hUCMSCs一样能够通过免疫调节和神经营养作用，发挥对视网膜结构和功能的保护作用。 5.S-hUCMSCs和hUCMSCs在体外与BV2小胶质细胞间接共培养能够通过旁分泌机制促进小胶质细胞凋亡，并抑制其炎症因子的分泌。
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