摘要
背景： 临床上严重创伤、肿瘤、骨坏死、骨感染等原因常导致大段骨缺损。自体骨被认为是修复大段骨缺损的金标准，但二次创伤及来源有限限制了其临床上广泛应用；异体骨及人工合成材料由于组织相容性差、成骨能力弱较少使用于临床。组织工程骨是修复大段骨缺损很好的方法，近年来成为研究的热点。以自体骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）为种子细胞构建的组织工程骨（Tissue-engineered bone，TEB）具有良好的修复骨缺损的能力。但是自体骨髓间充质干细胞受供体年龄、健康状况等原因影响数量有限、体外扩增耗时长，导致以自体骨髓间充质干细胞为种子细胞构建的组织工程骨无法满足临床随取随用的需求。而异基因骨髓间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞可以满足随取随用的要求。我们的前期研究显示，虽然异基因MSC免疫原性较低，但其潜在的免疫原性影响了其移植到宿主体内的成骨修复效果。前期研究中，应用CTLA4修饰骨髓来源的间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal stem cells，BMMSC）抑制活化的T细胞的免疫应答，以其构建的组织工程骨异基因移植到宿主体内可以有效成骨；其机制之一可能是CTLA4修饰可以增加MSC细胞表面EphB4的表达，增加移植修复区POSTEN的表达。但异基因MSC移植到宿主体内遇到的固有免疫应答尚不清楚，因此希望探索在移植过程中如何调节早期炎症反应以促进异基因MSC构建的组织工程骨有效成骨。 文献显示Vγ4T细胞是异基因移植早期发挥重要作用的免疫细胞之一，在移植早期分泌IL-17因子级联放大了早期炎症反应，缩短了异基因皮肤移植的生存时间。本研究拟通过体内外实验研究Vγ4T细胞对MSC成骨能力的影响；并构建HVEM修饰的MSC（HVEM-MSC）通过HVEM-BTLA抑制Vγ4T细胞功能，观察HVEM修饰的MSC异基因移植的成骨能力，探索HVEM修饰的MSC作为组织工程骨异基因种子细胞的可能性。 目的： 1.Vγ4T细胞对异基因MSC成骨能力影响的研究； 2.构建HVEM修饰的MSC，探讨其是否抑制Vγ4T细胞功能；观察其异基因移植成骨能力的变化。 方法： 1.贴壁法提取、培养的C57BL/6小鼠来源的骨髓MSC，用抗体刺激激活培育BALB/C小鼠脾脏来源的Vγ4T细胞，流式细胞术鉴定细胞纯度。 2.MSC与Vγ4T细胞按1:0、1:1、1:2、1:4比例共培养72小时后成骨诱导分化，应用碱性磷酸酶染色、茜素红染色评价成骨效果。选取MSC与Vγ4T细胞按1：4比例共培养，应用Western blotting和RT-PCR检测MSC成骨诱导分化情况；同时应用Elisa法检测共培养上清液中IL-17A和IFN-γ含量。 3.构建Vγ4T细胞清除的BALB/C小鼠模型及其股骨骨缺损模型。以C57BL/6小鼠来源的MSC构建组织工程骨并移植到Vγ4T细胞清除的BALB/C小鼠股骨骨缺损模型中。HE染色、免疫组化染色观察移植区域早期的炎症水平；应用X线和微CT影像学评价异基因MSC组织工程骨修复骨缺损的能力；组织切片后HE染色和Masson染色观察骨缺损区域成骨修复情况。 4.构建HVEM修饰的MSC，将其与Vγ4T细胞共培养。应用WB和RT-PCR检测HVEM-MSC的成骨诱导分化情况；碱性磷酸酶染色和茜素红染色评价HVEM-MSC的成骨效果；应用ELISA法检测共培养上清液中IL-17A和IFN-γ含量。 5.构建BALB/C小鼠股骨骨缺损模型，以HVEM修饰的C57BL/6小鼠来源的MSC构建组织工程骨并移植到BALB/C小鼠股骨骨缺损模型中。HE染色、免疫组化染色观察移植区域早期的炎症水平；应用X线和微CT影像学评价HVEM修饰的异基因MSC组织工程骨修复骨缺损的能力；组织切片后HE染色和Masson染色观察骨缺损区域成骨修复情况。 6.实验中产生的相关数据都用平均数±标准差（SD）的方式表示，多组数据采用单因素方差分析多个组间的比较，t检验检验两两组间的差异。*P＜0.05具有统计学意义，采用GraphPad Prism8.0来作统计分析和作图。 结果： 1.成功通过贴壁法从C57BL/6小鼠骨髓中提取培养出MSC，流式细胞术鉴定显示细胞表面高表达CD29、CD44、CD90，低表达CD11b、CD31、CD44。通过抗体刺激BALB/C小鼠脾脏淋巴细胞，培育出纯度91.6%的Vγ4T细胞。 2.MSC与Vγ4T细胞共培养体系中。WB检测MSC的成骨相关蛋白，与单纯MSC组相比，Vγ4T细胞共培养后的MSC组表达COL I更少（P＜0.05）、Runx2表达更少（P＜0.001）、Osterix表达更少（P＜0.01）、OCN表达更少（P＜0.0001）；RT-PCR检测MSC的成骨相关蛋白基因转录水平，与单纯MSC组相比，Vγ4T细胞共培养后的MSC组COL I转录更少（P＜0.01）、Runx2转录更少（P＜0.01）、Osterix转录更少（P＜0.0001）、OCN转录减少（P＜0.001）碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察到MSC碱性磷酸酶活性降低，钙结节数量减少。随着共培养体系中Vγ4T细胞比例越高，MSC成骨能力越差。 3.在体内实验中，将C57BL/6小鼠MSC构建的组织工程骨分别移植到Vγ4T细胞清除的BALB/C小鼠股骨骨缺损模型和野生型BALB/C小鼠股骨骨缺损模型中。X射线和微CT发现Vγ4T细胞清除小鼠组骨缺损区域新生骨体积更大、骨密度更高（P＜0.001）；组织切片染色有相似的结果。HE染色和免疫组化染色显示在Vγ4T细胞清除小鼠组移植早期（3天，7天）炎症细胞浸润更少，炎性介质IL-17A和IFN-γ表达更低。 4.在HVEM修饰的MSC与Vγ4T细胞共培养体系中，实验组（HVEM-MSC+Vγ4T）与对照组（MSC+Vγ4T）。ELISA观察到实验组共培养上清中IL-17A较对照组降低（P＜0.001），IFN-γ的含量较对照组低（P＜0.0001）；WB结果显示实验组成骨相关蛋白COL I较对照组增高（P＜0.01）、Runx2较对照组稍增高（P＜0.05）、Osterix较对照组增高（P＜0.01）、OCN表达较对照组增高（P＜0.001）；RT-PCR结果显示实验组COL I、Osterix、OCN转录水平均比对照组的高（P＜0.01）；碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示实验组相较于对照组，碱性磷酸酶活性更强，钙结节数量更多（P＜0.0001）。 5.在体内实验中，将HVEM-MSC构建的组织工程骨（实验组）和MSC构建的组织工程骨（对照组）分别移植到BALB/C小鼠股骨骨缺损模型中。实验组和对照组相比较，HE染色和免疫组化染色结果显示实验组移植早期（3天、7天）移植物周围炎症细胞浸润更少，IL-17A和IFN-γ表达水平更低。X线和微CT显示实验组骨缺损区域新生骨体积更大（P＜0.0001），骨密度更高（P＜0.001），骨小梁数量更多(P＜0.01)、骨小梁厚度更厚（P＜0.05）。但以HVEM-MSC为种子细胞构建的组织工程骨移植入Vγ4T细胞清除小鼠体内炎症水平和成骨质量与以HVEM-MSC为种子细胞构建的组织工程骨移植入野生型小鼠相差不大。 结论： 1.Vγ4T可以抑制MSC成骨分化，其机制可能是通过分泌IL-17A和IFN-γ抑制MSC的成骨分化能力。 2.清除Vγ4T细胞可以降低异基因MSC组织工程骨移植物周围早期炎症水平，从而促进异基因组织工程骨成骨和修复骨缺损。 3.在HVEM-MSC与Vγ4T细胞共培养体系中，HVEM-MSC可以抑制Vγ4T细胞分泌IL-17A和IFN-γ，恢复MSC因为Vγ4T细胞存在而降低的成骨分化能力。 4.异基因HVEM-MSC构建的组织工程骨在小鼠股骨骨缺损区域可以降低移植物周围早期局部炎症反应,促进骨缺损修复。
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