摘要
鸽新城疫病毒感染，或称为鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigeon paramyxovirus type1，PPMV-1）病，是由基因Ⅵ型新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的，对鸽具有宿主特异性的一类具有较高发病和死亡率的传染病，对我国养鸽业造成了极大的经济损失。研究表明，LaSota疫苗对一些基因Ⅵ型毒株仅能提供部分保护。由于不同基因型之间的NDV存在一定的抗原性差异，因此开发出与流行基因型相匹配的疫苗无疑是有效防控新城疫的重要手段之一。为此，本研究开展以下3个方面的工作： 1.NDV VIb亚型反向遗传操作平台的建立 选用基因VIb亚型PPMV-1流行株HD为亲本毒株，利用同源重组的方法构建BAC-HD全长质粒，同时将F基因裂解位点替换为天然弱毒株LaSota相应序列并以此作为分子标签。将BAC-HD全长质粒与3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L共转染BSR-T7/5细胞，并成功拯救出致弱的病毒rHD，其血凝价为8log2，与亲本株HD相比，其HA效价升高了4倍。生物学特性测定结果表明，rHD株脑内接种致病指数（ICPI）为0、鸡胚平均致死时间（MDT）大于120h、鸡胚半数感染量（EID50）为10-8.2/0.2mL。在SPF鸡胚上连续传15代，分子标签未发生突变。rHD株反向遗传操作平台的建立为后续研究新城疫病毒各基因功能、开发新型新城疫病毒疫苗的研究奠定了基础。 2.嵌合NDV VIb亚型病毒致弱疫苗候选株的构建 以BAC-LaSota为骨架，将NDV VI型rHD株的F和HN基因的ORF片段替换至LaSota疫苗株的相应区域，构建双基因替换的重组转录载体BAC-L+HD，拯救并获得嵌合病毒rL+HD。致病性结果表明，嵌合病毒rL+HD株的ICPI为0，MDT大于120h，EID50为10-8.5/0.2mL，符合弱毒标准。其HA效价为8log2，与HD株相比，HA效价升高了4倍。稳定性实验结果表明，嵌合病毒rL+HD能够稳定鸡胚传代15代。上述结果表明拯救的病毒毒力已致弱、血凝价升高、遗传稳定性良好，是良好的疫苗候选株。 3.两株灭活疫苗的免疫效果评价 为筛选免疫原性良好的鸽新城疫弱毒疫苗株，对两株弱毒株的安全性和免疫原性进行了初步评估。分别使用rHD和rL+HD重组致弱株制备灭活疫苗，与灭活LaSota疫苗一起，各免疫35日龄的鸽子10只，同时设置不免疫对照组10只。免疫14d后，观察期内鸽子没有出现发病和死亡的情况，rHD、rL+HD和LaSota组HI抗体效价均达到1.8log2；免疫21d后，三组HI抗体效价均达到6log2。攻毒保护实验显示，rHD和rL+HD组在观察期内未出现任何的临床症状，免疫保护率为100%，并且攻毒后第7d所有鸽的口咽及泄殖腔均未检测到病毒；LaSota对照组虽然抗体水平与rHD和rL+HD组相当，但在攻毒后第7d依然存在排毒情况；而空白对照组的死亡率达40%，且在攻毒后第7d所有鸽的口咽及泄殖腔均可检测到病毒。上述试验表明，rHD和rL+HD有望成为新的弱毒疫苗候选株。 综上所述，本研究利用反向遗传操作技术构建了PPMV-1流行毒株HD的致弱株rHD及rL+HD，其生物学特性及免疫保护试验结果表明rHD与rL+HD均是良好的疫苗候选株，为开发鸽专用新城疫疫苗奠定了基础。
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