摘要
单核细胞增生李斯特菌（简称单增李斯特菌，Listeria monocytogenes,LM）是一种重要的食源性人畜共患病原菌，该菌在自然界广泛存在，可抵抗外界多种不利因素的影响，如酸、碱、渗透压和氧化环境。动物或人类食入单增李斯特菌污染的食物，会引起李斯特菌病，可导致败血症、脑膜炎、胃肠炎及孕妇流产等，老人、幼儿、孕妇及免疫力低下者易感，虽然发病率不高，但死亡率可达30%。 单增李斯特菌进入机体后，可以在宿主细胞内增殖，并通过多种毒力因子的作用逃离吞噬体，继而感染相邻细胞。在机体内，单增李斯特菌在血液、吞噬体中会遇到氧化环境的威胁，所以抗氧化应激能力是单增李斯特菌感染并在胞内增殖所必需的。双元调控系统HssSR（血红素传感系统，Heme-Sensor System）主要通过调节HrtAB（血红素转运系统，Heme Regulated Transporter）排出多余的血红素来避免氧化环境带来的损伤，但其对抗氧化应激的具体调控机制尚不明确。因此，我们将针对双元调控系统HssSR在单增李斯特菌中抗氧化应激和致病性的分子机制进行研究。1.构建hssS/hssR基因缺失株，比较hssS/hssR基因缺失对单增李斯特菌抗应激能力及毒力的影响；2.分析氧化条件下，HssSR的响应情况；3.筛选HssSR调控的靶基因，探明HssSR介导单增李斯特菌抗氧化应激的分子机制。 1.构建hssS/hssR基因缺失株，比较hssS/hssR基因缺失对单增李斯特菌抗应激能力及毒力的影响 利用同源重组的方法构建hssS/hssR基因缺失株，然后通过生长曲线测定、应激存活实验比较hssS/hssR基因缺失株对单增李斯特菌抗氧化应激能力的影响。结果显示hssS/hssR基因缺失后，在氧化环境下生长能力显著下降，抗氧化应激能力降低，说明hssS/hssR可能在单增李斯特菌抗氧化应激过程中发挥了抗氧化的作用；通过细胞侵袭试验表明,hssS/hssR基因缺失显著增强单增李斯特菌对肠上皮细胞Coca-2的侵袭能力；亦显著增强该菌抵抗巨噬细胞RAW264.7吞噬的能力以及在胞内的增殖能力。动物感染试验显示，hssS/hssR基因缺失显著增加单增李斯特菌在小鼠和鸡胚肝脏中的载菌量，表明hssS/hssR基因缺失可以增强单增李斯特菌的毒力。 2.分析氧化条件下，HssSR的响应情况 利用原核表达载体pET-28a构建了hssS/hssR基因重组表达载体；诱导表达成功并获得了纯化的重组蛋白HssS、HssR；利用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体。利用回补质粒pERL3构建了回补株C?hssS/hssR；Western blot结果显示hssS/hssR基因回补成功；应激存活试验表明回补hssS/hssR基因恢复了单增李斯特菌的氧化应激存活能力。Western blot显示，在氧化条件下，单增李斯特菌的HssR表达水平显著下调。说明hssS/hssR可能参与单增李斯特菌抗氧化应激的作用。 3.筛选HssSR调控的靶基因，探明HssSR介导单增李斯特菌抗氧化应激的分子机制。 为了探索HssSR介导单增李斯特菌抗氧化应激与致病性的分子机制，筛选了HssSR对kat、sod和fri等参与氧化应激相关基因的调控作用。首先利用表达质粒分别构建了kat、sod和fri启动子的GFP报告质粒；将报告质粒转入亲本株10403S、缺失株?hssS/hssR和回补株C?hssS/hssR，通过酶标仪检测报告基因的表达情况，结果显示氧化应激条件下，hssS/hssR缺失能上调sod和fri报告基因的表达；进一步利用凝胶迁移阻滞试验（EMSA）验证HssR与kat、sod和fri启动子的结合能力，结果表明HssR并不能有效结合sod和fri启动子，提示HssR对sod和fri的调控作用较弱。
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