摘要
糖代谢紊乱导致血糖调控异常，诱导机体糖尿病的发生，最终诱发心血管并发症，糖尿病肾病、足部坏疽等多种并发症。α-葡萄糖苷酶是人体糖代谢过程中的关键酶，其功能是将消化道中的低聚糖转化为葡萄糖。此外，胰岛素抵抗和氧化应激均是导致Ⅱ型糖尿病的根本原因。因此，抑制α-葡萄糖苷酶活性，改善胰岛素抵抗和减轻氧化应激是改善糖尿病的有效途径。三叶苷（Trilobatin）是一种天然的二氢查尔酮类化合物，存在于多穗石柯（甜茶）、苹果属、马钱子叶和番茄等植物中。三叶苷已被证明具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病和抗HIV等多种生物活性，但目前三叶苷降血糖机制的深入研究较少。因此，本研究从α-葡萄糖苷酶、胰岛素抵抗HepG2细胞以及Ⅱ型糖尿病小鼠三个水平深入揭示三叶苷调节糖代谢的作用及机制。主要研究内容和结果如下： 1.通过酶抑制动力学和多种光谱分析技术研究三叶苷对α-葡萄糖苷酶的抑制及相互作用机制。动力学结果表明，三叶苷可逆抑制α-葡萄糖苷酶活力，其半数抑制浓度IC50值为（0.24±0.02）×10-3mol L-1，且抑制类型是非竞争型抑制，Ki为（8.49±0.70）×10-4mol L-1。荧光光谱及热力学分析表明，α-葡萄糖苷酶的内源荧光在三叶苷的作用下静态猝灭，两者结合位点数为1且主要受氢键和范德华力的作用。同步荧光、傅里叶红外光谱（FT-IR）和圆二色谱（CD）的结果表明，三叶苷与α-葡萄糖苷酶的相互作用会改变酶的构象。分子模拟对接结果显示，三叶苷能够插入α-葡萄糖苷酶活性空腔，抑制α-葡萄糖苷酶活性。 2.采用胰岛素诱导HepG2细胞，研究三叶苷对胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢的调节作用及机制。结果显示，胰岛素抵抗HepG2细胞在经过三叶苷处理后，葡萄糖消耗量显著升高，且细胞内糖原含量增加1.84倍，己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）活力均提高0.57倍及甘油三酯（TG）含量降低。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结果表明，三叶苷能够增加胰岛素抵抗HepG2细胞内磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、胰岛素受体（IR）和胰岛素受体底物-2（IRS-2）mRNA的相对表达水平并降低糖原合成酶激酶（GSK-3β）mRNA的相对表达水平，进而促进细胞内糖原的合成，改善胰岛素抵抗。三叶苷干预后，胰岛素抵抗HepG2细胞内活性氧（ROS）水平和丙二醛（MDA）含量明显降低，谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力明显升高。三叶苷能够上调胰岛素抵抗HepG2细胞内核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1）和还原型辅酶/醌氧化还原酶-1（NQO-1）mRNA的相对表达水平，并下调Kelch样ECH相关蛋白-1（Keap-1）mRNA的相对表达水平，减轻氧化应激。 3.采用链佐脲菌素（STZ）诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，研究三叶苷对其糖代谢的调节作用及机制。经过4周灌胃三叶苷处理，Ⅱ型糖尿病小鼠的体重（BW）下降、摄食量、饮水量、空腹血糖（FBG）水平和糖化血清蛋白（GSP）含量明显降低，葡萄糖耐受性明显增加。三叶苷对Ⅱ型糖尿病小鼠的空腹血清胰岛素（FINS）的分泌，内稳态模型评估-胰岛素抵抗（HOMA-IR）、内稳态模型评估-β细胞功能（HOMA-β）和胰岛素敏感性检测指数（QUICKI）均有明显的改善作用。灌胃三叶苷4周后，Ⅱ型糖尿病小鼠的肝糖原含量明显增加，血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活力明显降低。三叶苷能够降低Ⅱ型糖尿病小鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，增加高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，改善其血脂异常。根据苏木精-伊红（Hamp;E）染色结果发现，灌胃三叶苷4周后，Ⅱ型糖尿病小鼠的胰岛面积明显增大、β细胞凋亡抑制和肝损伤减轻。qRT-PCR试验结果表明，三叶苷能够增加Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏中PI3K、Akt、IR和IRS-2转录水平并降低GSK-3β转录水平，进而促进肝糖原的合成。Ⅱ型糖尿病小鼠的肝脏在灌胃三叶苷4周后，MDA含量降低，GSH含量增加、SOD和CAT活力增强；并且Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏中Nrf2、HO-1和NQO-1mRNA的相对表达水平升高，Keap-1mRNA的相对表达水平降低，从而减轻Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏氧化应激。
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