摘要
草鱼（Ctenopharyngodonidella）是我国人工养殖规模最大的大宗淡水经济鱼类，近5年来产量稳中有升，且始终占据产量第一的位置。但草鱼集约化养殖过程中爆发的各类细菌性疾病严重制约着草鱼养殖业的健康发展。目前常使用抗生素来应对草鱼细菌性疾病，但抗生素不当使用极易使环境细菌产生耐药性，从而引发细菌耐药性危机。β-防御素（β-defensin）是一类富含半胱氨酸的小型阳离子肽，在宿主先天免疫防御中扮演着重要角色。β-防御素在自然界各类生物体中广泛存在。目前研究发现，β-防御素除了具有直接的抗病原微生物活性外，还参与机体的免疫调节，在天然性免疫和适应性免疫中发挥着重要作用。本研究分析了草鱼β-防御素1（Ctenopharyngodonidellaβ-defensin1,CiBD1）抗菌功能，探究了其趋化活性与对嗜水气单胞菌灭活疫苗（Aeromonashydrophila,A.hydrophila）的佐剂效应，为CiBD1在生产实践中的应用奠定了良好的理论基础，相关实验结果如下： 1.CiBD1是一类阳离子两亲性蛋白，具有高度保守的3个β折叠结构。 通过ClustalOmega多序列比对和I-TASSER二级结构预测，发现CiBD1是一类具有两亲性、富含半胱氨酸的小分子阳离子肽，其结构在硬骨鱼类中高度保守。 2.CiBD1在草鱼各组织呈组成型表达并高表达于黏膜组织。 为了探究CiBD1的生理及免疫防御作用，我们研究了CiBD1基因在正常生理条件和病原刺激下草鱼不同组织中的转录水平，结果显示，在正常生理条件下，CiBD1广泛表达于各组织器官，其中皮肤和眼转录水平最高；嗜水气单胞菌刺激后72h，草鱼各组织中CiBD1转录水平显著升高，尤其是皮肤、眼、鳔和后肠等黏膜免疫相关的组织中CiBD1的转录水平水平升高较为明显。 3.CiBD1重组蛋白对鱼类常见细菌和小瓜虫均具有抑制或杀灭活性。 构建pET-32a-CiBD1原核表达载体，IPTG诱导表达后利用Ni2+亲和层析法和肠激酶酶切等获得CiBD1重组蛋白，通过CFU平板法验证了CiBD1重组蛋白的抑菌活性，结果表明，当CiBD1重组蛋白浓度达到200μg/mL时，对革兰氏阳性菌（Gram-positivebacteria,G+）及革兰氏阴性菌（Gram-negativebacteria,G-）都具有显著的抑制活性；此外，CiBD1重组蛋白对小瓜虫（Ichthyophthiriusmultifiliis）滋养体具有呈浓度依赖型的杀灭活性，40μmol/L的蛋白作用20min可杀灭70%的小瓜虫滋养体。 4.CiBD1重组蛋白可以趋化草鱼白细胞，增强嗜水气单胞菌疫苗免疫保护力。 使用Percoll梯度离心法分离草鱼头肾白细胞，通过Transwell趋化实验表明，CiBD1重组蛋白在50ng/mL时对草鱼原代白细胞趋化活性最佳；通过个体实验探究了CiBD1重组蛋白对嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫佐剂效应，发现添加CiBD1佐剂组死亡率显著低于单独疫苗组，且该组IgM和MHCⅡ等免疫分子的转录水平及血清中补体C3和溶菌酶含量都显著高于对照组。 综上所述，CiBD1是一类高度保守的小分子阳离子抗菌肽，CiBD1呈组成型分布在草鱼各组织并高表达于一些黏膜组织，在机体受到病原刺激时，一些与外周环境接触密切的黏膜组织中的CiBD1转录水平更显著。CiBD1重组蛋白不仅在体外对鱼类常见细菌与小瓜虫具有一定的杀灭活性，而且对草鱼头肾淋巴系细胞和髓系细胞均表现出较强的趋化活性。CiBD1可以提高嗜水气单胞菌灭活疫苗的保护率和抗病力，具有良好的免疫佐剂效应。本研究结果提示CiBD1重组蛋白在草鱼抗感染免疫中发挥着重要作用，在水产养殖的生产实践中具有潜在的应用价值。
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