摘要
水牛生长速度缓慢，性成熟较晚。生长速度较快的犊牛产犊年龄小，出栏周期短，繁殖力更高，饲养成本更低。因此，如何促进水牛犊牛的生长一直都是国内外学者研究的热点。本实验室前期构建的非抗性筛选生长抑素（SS）和皮质抑素（CST）双表达DNA疫苗可以显著提高小鼠的生长速度，虽然探索了用其鼻腔免疫水牛犊牛的剂量，但增重效果不显著。因此需要开展进一步的试验来探索、优化犊牛接种该疫苗的免疫程序，为水牛场的规模化养殖提供合理的免疫方案，为该DNA疫苗的推广使用提供理论依据。本试验从免疫方式和免疫剂量两个方面来探讨犊牛接种双表达DNA疫苗的免疫效果、促生长效果以及安全性，主要研究内容和结果如下： 1.工程菌的鉴定与遗传稳定性 将实验室保存的重组菌C500（pVGS/2SS-2A-S/CST-asd）复苏培养，提取质粒，经双酶切和测序鉴定正确后，连续培养50代，分别取2、10、20、30、40、50代的菌液进行PCR扩增，均可扩出目的基因2A-S/CST片段、抗性筛选基因asd片段、减毒基因crp片段以及沙门氏菌的特异性序列invA基因片段，表明重组菌在传代过程中未发生质粒丢失、毒力返强现象；绘制重组菌和对照菌的生长曲线，结果发现，含目的质粒的重组菌和不含目的质粒的对照菌生长趋势趋于一致，说明导入双表达质粒并未影响该减毒沙门氏菌的正常生长。 2.双表达DNA疫苗接种途径对犊牛免疫反应和生长的影响 27头2~6月龄水牛犊牛，随机分成四组，分别采用口服（O组）、喷鼻（N组）、口服+喷鼻（ON组）方式接种双表达DNA疫苗，浓度均为3×107CFU/mL，对照组（C）使用PBS进行口服+喷鼻处理，2w后加强免疫一次。结果表明：三种免疫方式均可诱导犊牛产生SS抗体和CST抗体；初次免疫后2w，N和ON组阳性率最高，均为85.71%，试验末期，ON组阳性率下降到14.29%，O和N组均检测不到抗体。从增重来看，2w时，ON组的平均日增重显著高于O、N和C组（P＜0.05）；0~10w，与C组相比，O、N和ON组的增重分别提高了5.26%、10.53%、15.79%；初免后10w，ON组的胸围、腿臀围均显著高于C组（P＜0.05）。激素检测结果表明，各组GH、IGF-1、T3的含量，ON＞N＞O＞C组；其中2w时，O、N和ON组IGF-1的浓度显著高于C组（P＜0.05）；6w时，ON组T3和T4的浓度均显著高于O和C组（P＜0.05）。细胞因子检测结果发现，三个试验组IL-4和INF-γ的含量均高于C组，表明三种免疫方式都能激发机体产生体液免疫和细胞免疫应答。血生化指标检测结果发现，各组犊牛血清中总蛋白、葡萄糖、游离脂肪酸和尿素氮的含量差异不显著（P＞0.05），表明该双表达DNA疫苗对犊牛血清代谢物含量无明显影响。 3.双表达DNA疫苗接种剂量对犊牛免疫效果和生长的影响 24头2~6月龄水牛犊牛随机分为4组，分别以喷鼻3×107CFU/mL+口服3×1010CFU/mL（NO10组）、喷鼻3×107CFU/mL+口服3×109CFU/mL（NO9组）、喷鼻3×107CFU/mL+口服3×108CFU/mL（NO8组）的方案进行免疫，对照组（C1）使用PBS进行口服+喷鼻处理，2w后以相同的程序加强免疫一次。结果发现：初次免疫后2w，NO10、NO9、NO8组的阳性率分别为50.00%、83.33%、83.33%，加强免疫后各组阳性率并未提高，反而有所下降；各个时期，各组犊牛血清SS抗体水平差异不显著（P＞0.05）；纵观整个试验周期，无论是SS抗体还是CST抗体，NO8组的抗体水平和阳性率最高。不同时期，NO8组的平均日增重最高；0~10w，NO10组、NO9组、NO8组犊牛的平均日增重分别比对照组提高了13.04%、13.04%、17.39%。从体尺变化来看，10w，NO8组的胸围、腿臀围显著高于对照组（P＜0.05）。激素检测结果表明，各个时期，NO8组犊牛血清中GH、IGF-1的含量均高于另外三组，其中6w时，NO8组IGF-1的含量显著高于对照组（P＜0.05）。 4.安全性检测 对免疫后牛舍不同时期的水样、土样和粪样以及提取的犊牛血液基因组DNA进行目的基因扩增，均未检测到目的基因，表明该重组菌对环境以及动物都是安全的。在初次免疫后2w和6w，检测各组犊牛的血液成分（WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW），发现三种免疫方式对犊牛血液各成分无明显影响，说明该双表达DNA疫苗对犊牛的血液循环系统和免疫细胞没有影响，初步证明了该疫苗免疫大动物也是安全的。 综上所述，SS和CST双表达DNA疫苗对犊牛及环境都是安全的，采用口服3×108CFU/mL+喷鼻3×107CFU/mL的免疫程序最佳，水牛犊牛的增重效果较好。
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