摘要
类风湿性关节炎（Rheumatoidarthritis,RA）是一种常见的以慢性滑膜炎病变为关键特征的自身免疫性疾病。目前RA的机制尚不清楚，但是炎性因子在RA的发病中至关重要。滑膜巨噬细胞等免疫细胞以及滑膜成纤维细胞释放相应的炎性介质是导致RA滑膜炎症和骨破坏的主要因素。 很多证据表明，迷走神经刺激（Vagusnervestimulation,VNS）能激活胆碱能抗炎通路（Cholinergicanti-inflammatorypathway,CAP）抗炎，从而缓解RA的滑膜炎症和骨破坏。由于耳甲是迷走神经在哺乳动物体表唯一的分布区，耳穴迷走神经刺激（TranscutaneousAuricularVagusNerveStimulation,taVNS）的抗炎效应很可能是通过刺激耳甲区的迷走神经发挥作用的。 鉴于taVNS和VNS有相似的结构基础和功能基础，且已有动物实验与临床研究均表明VNS能够通过CAP缓解RA的滑膜炎症，taVNS的抗炎效应却尚未在RA的疾病模型中得到验证。因此，本文提出taVNS可能通过CAP缓解RA的滑膜炎症的科学假说。 目的： 1、明确taVNS干预对胶原诱导关节炎（Collagen-inducedarthritis,CIA）大鼠关节滑膜炎的缓解效应。 2、阐明taVNS干预缓解实验性RA关节炎效应与迷走神经完整性的关系。 3、从外周胆碱能抗炎通路角度探讨taVNS缓解关节炎症效应的细胞内分子机制。 方法： 本实验共分成以下四个部分：实验一观察taVNS对脑干孤束核（NucleusTractusSolitarius,NTS）与迷走神经背核（dorsalmotornucleusofthevagus,DMV)核团的激活情况;实验二观察taVNS对CIA大鼠滑膜炎症的缓解效应;实验三观察迷走神经切断对taVNS缓解滑膜炎症的效应的影响;实验四观察抑制α7AchR(MLA）对taVNS调节滑膜炎症效应的影响。其中，将实验二分为Control组，CIA组和taVNS组;将实验三分为CIA组，CIA+迷走神经切断（vagotomy,VGX）组和CIA+VGX+taVNS组;将实验四分为CIA组，CIA+甲基牛扁亭柠檬酸盐（Methyllycaconitinecitrate,MLA）组，CIA+MLA+taVNS组。选10只成年健康雄性SD(SpragueDawley）大鼠（180±20g）作为Control组，余下各组均已造模，每组10只，造模成功率为80%。 初始免疫4d前，CIA+VGX组和CIA+VGX+taVNS组大鼠在进行造模前行迷走神经切断术预处理，术后恢复4天。CIA大鼠造模成功后，将taVNS组大鼠用异氟烷轻度吸入麻醉，并予以耳甲迷走神经刺激，具体方法为将电子针疗仪正负极连接在两端有电磁铁的铁片上，依靠磁铁吸力固定于大鼠双侧耳甲区，以大鼠耳廓保持连续颤动为基准。刺激参数：连续波，频率20Hz，强度1mA,30min/d,连续28d。治疗时间为上午9～11点。CIA+VGX+taVNS组和CIA+MLA+taVNS组大鼠采用同样的干预方式、频次和时间。CIA+MLA+taVNS组大鼠于taVNS干预前15分钟腹腔注射MLA3mg/kg行MLA预处理，1次/d，连续干预28天。 观察各组大鼠的痛行为学变化、足趾肿胀度变化、关节炎指数变化、组织病理学变化以及滑膜组织蛋白表达水平。采用Vonfrey探测器检测CIA大鼠的足底机械缩足反射阈值（MechanicalWithdrawalThreshold,MWT)，采用Ugo-37370型辐射热测痛仪检测足底热痛潜伏期（ThermalWithdrawalThresholds,TWT)，采用鼠爪肿胀测量仪检测足趾肿胀度（PawVolume)，并评估关节炎指数（AthritisIndex,AI)。采用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosinStaining,HE）染色观察CIA大鼠滑膜炎症的病理学变化，采用多因子试剂盒（MesoScaleDiscovery,MSD）检测CIA大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β）的含量。采用免疫印迹法（Westernblotting,)WB）检测CIA大鼠α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7NicotinicAcetylcholineReceptors,α7AchR)，磷酸化核因子κBP65(PhosphorylatednuclearfactorkappaBP65,NF-κBp65)，磷酸化核因子κBp-p65(PhosphorylatednuclearfactorkappaBp-p65NF-κBp-p65）和TNF-α蛋白表达水平。 结果： 结果一：观察taVNS对脑干NTS与DMV核团的激活情况 以c-Fos蛋白表达的神经元数量为标准。免疫组化结果分析显示，经taVNS干预后，与CIA组大鼠相比，taVNS组大鼠的NTS区的c-Fos阳性神经元以及DMV区的c-Fos和ChAT+共标神经元的激活数量显著增多（P＜0.01,P＜0.05),由于NTS是脑内迷走神经感觉中枢，DMV则是迷走神经运动中枢，支配迷走传出神经的活动，因此这部分结果说明了taVNS除了可以激活迷走神经在脑内传入中枢外，还能通过迷走反射激活迷走神经的传出中枢，从而可能激活完整的迷走神经抗炎通路。 结果二：taVNS对CIA大鼠滑膜炎症的缓解效应 1、taVNS对CIA大鼠关节炎指数与足趾肿胀度的影响 1.1taVNS对CIA大鼠关节炎指数的影响 初次免疫后第7天，各组间大鼠关节炎指数的差异无统计学意义。初次免疫后第14天，造模成功的各组CIA大鼠后肢双足关节炎指数＞3分。初次免疫后第14天，CIA组大鼠的双足关节炎指数分值迅速升高至6-8分，显著高于Control组（P＜0.05)。经taVNS干预两周后（即初次免疫后第28天），与Control组大鼠相比，CIA组大鼠的双足关节炎指数缓慢下降直至干预结束，最终稳定至4-6分（P＞0.05)，提示未经任何干预，CIA大鼠的关节炎指数仍能轻度恢复。经taVNS干预两周后，与CIA组大鼠相比，taVNS组大鼠双足关节炎指数显著下降直至干预结束，最终稳定至2-4分（P＜0.05)，提示taVNS可显著降低CIA大鼠的关节炎指数，显著减轻CIA大鼠关节炎的严重程度。1.2taVNS对CIA大鼠的足趾肿胀度的影响造模前至初次免疫后第7天，各组间大鼠双侧后肢足趾肿胀度的差异无统计学意义。初次免疫后第14天，CIA组大鼠的双侧后肢足趾肿胀度迅速上升，显著高于Control组（P＜0.05)，并在初次免疫后第21天，CIA组大鼠的双足足趾肿胀度达到峰值。初次免疫后第28天，与Control组相比，CIA组大鼠的双足足趾肿胀度缓慢下降直至干预结束（P＜0.05)，提示未经任何干预，CIA大鼠的足趾肿胀度仍能轻度缓解。经taVNS干预两周后，与CIA组大鼠相比，taVNS组大鼠的双足足趾肿胀度显著下降直至干预结束（P＜0.05)，提示taVNS可显著减轻CIA大鼠的足趾肿胀度。 2、taVNS对CIA大鼠MWT和TWT的影响初次免疫后第7天，造模前各组间大鼠的双侧后肢MWT和TWT的差异无统计学意义。初次免疫后第14天，与Control组大鼠相比，CIA组大鼠的MWT和TWT显著下降（P＜0.05)。初次免疫后第28天，与Control组大鼠相比，CIA组大鼠的MWT和TWT缓慢升高直至干预结束（P＜0.05)，提示未经任何干预，CIA组大鼠的MWT和TWT仍能轻度缓解。经taVNS干预两周后，与CIA组相比，taVNS组大鼠MWT和TWT显著升高直至干预结束（P＜0.05)，提示taVNS能显著提高CIA大鼠的MWT和TWT并有效缓解CIA大鼠的关节炎疼痛。 3、taVNS对CIA大鼠足趾外观和关节组织形态的影响 据外观图可见：Control组大鼠的后肢生长健康，踝关节以及各足趾无红肿改变，活动自如，CIA组大鼠的后肢踝关节以及各足趾红肿明显，甚至僵硬变形，符合RA的特征性改变，taVNS组大鼠后肢红肿明显减轻，活动相对自如。 据HE染色可见：Control组大鼠踝关节滑膜结构完整，关节面光滑平整，滑膜细胞排列整齐，无炎症浸润和组织碎片。与Control组大鼠相比，CIA组的大鼠关节腔变窄，关节面粗糙不平，滑膜组织内有大量的炎症细胞浸润。与CIA组大鼠相比，taVNS组大鼠关节滑膜的炎性反应减轻，滑膜层较薄滑膜细胞增生数量减少，提示taVNS能改善CIA大鼠的足趾外观以及关节组织的病理形态。 结论： taVNS能有效缓解CIA大鼠的关节滑膜炎症状，且此效应依赖于完整的迷走神经和胆碱能抗炎通路的激活。
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