摘要
目的： 本研究致力通过体外实验探索益气除痰方联合细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes cell，CTL）对肺癌A549细胞生物学行为的影响及作用机制，为肺癌的中医药治疗以及过继性免疫细胞治疗提供实验和理论依据。 方法： 1.采用密度梯度离心法和细胞因子刺激法从外周血单个核细胞中诱导树突状细胞，流式细胞仪对其细胞表型CD86、CD11c进行鉴定。使树突状细胞提呈A549细胞肿瘤抗原，并与T淋巴细胞共培养，刺激诱导成CTL，并用流式细胞仪鉴定细胞表型； 2.实验将肺癌A549细胞为四个组，空白血清组、益气除痰方组、CTL组和联合组。空白血清组作为对照组含15%浓度的大鼠空白血清，益气除痰方组予15%浓度的益气除痰方大鼠含药血清干预，CTL组予诱导成功的CTL细胞作为干预（效靶比10∶1），联合组为15%浓度的益气除痰方含药血清和CTL细胞（效靶比10∶1）联合干预。在显微镜下观察干预48h之后，各组细胞的形态学变化； 3.利用CCK-8实验和EdU-488实验检测四个处理组的细胞活力与增殖能力；肿瘤细胞克隆形成实验检测四个处理组的肿瘤细胞克隆形成能力； 4.流式荧光发光法检测四个处理组细胞上清液中γ-干扰素的浓度； 5.线粒体膜电位流式荧光检测四个处理组细胞线粒体膜电位的变化情况； 6.利用实时荧光定量PCR实验和蛋白印迹技术检测各组细胞Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路的相关基因与蛋白的表达情况。 结果： 1.经细胞因子刺激，并以A549细胞抗原作为抗原冲击后，单核细胞成功诱导为树突状细胞；树突状细胞作为抗原提呈细胞，与提取的T细胞共培养，分化为特异性细胞毒性T淋巴细胞，并经流式细胞术鉴定细胞表型CD3+CD8+CD28+，纯度可达89%以上。 2.空白血清组细胞生长状态较佳，胞核清晰，胞体圆润饱满；益气除痰方组的细胞呈现“拉丝”状，胞体胞核模糊不清，细胞呈长梭型，胞核空泡样改变；CTL组与联合组细胞间隙变大，细胞间联系不紧密，细胞空泡样改变较多。 3.CCK-8检测结果显示，与空白血清组相比，其余三组的细胞活力均显著性下降，益气除痰方组、CTL组、联合组的细胞活力分别为：（0.73±0.01）、（0.69±0.01）、（0.65±0.02），差异具有统计学意义（P＜0.01）；相较于益气除痰方组，CTL组和联合组的细胞活力更低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 4.EdU-488实验检测结果四组细胞2小时内细胞的增殖比例分别为：0.33±0.05，0.25±0.03，0.18±0.02，0.13±0.03；与空白血清组相比，其余3组的细胞增殖数量均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。 5.细胞因子检测结果显示，与空白血清组相比，益气除痰方组的γ-干扰素含量没有增加；而CTL组与联合组的γ-干扰素含量则显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.001）；CTL组与联合组之间的γ-干扰素浓度无统计学意义。 6.肿瘤细胞克隆形成实验结果显示，空白血清组、益气除痰方组、CTL组与联合组的克隆形成数分别是：122±6.25，121.67±4.04，89.33±5.51，81.67±7.57。与空白血清组比较，CTL组与联合组的克隆形成能力受到明显抑制（P＜0.001）。 7.线粒体膜电位流式荧光检测显示，与空白血清组相比，其余三组流式图的FITC-A(+)，PE-A（-）区域细胞均有增加，红色绿色荧光的比值降低，CTL组与联合组具有显著差异（P＜0.01）,表明益气除痰方和CTL可以降低A549细胞线粒体膜电位,促使早期凋亡发生。 8.实时荧光PCR结果显示，与空白血清组比较，经过48小时干预之后，A549细胞中Fas、Bax、Caspase-3的相对表达量呈上升趋势，而Bcl-2的相对表达量呈下降趋势。 9．蛋白质印迹检测显示，与空白血清组比较，益气除痰组、CTL组、联合组的促凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达水平提高了，而Bcl-2的表达水平在下降。其中，CTL组和联合组的效果最明显，表明益气除痰方含药血清与CTL细胞具有对Bax/Bcl-2/Caspase-3通路相关蛋白表达的影响具有协同作用。 结论： 本次研究证明了益气除痰方、CTL细胞对肺腺癌A549细胞的生长活力、增殖、克隆形成能力均有抑制作用，并且能促进其早期凋亡，二者具有协同作用；益气除痰方联合CTL细胞可能是通过激活Bax/Bcl-2/Caspase-3通路抑制肺癌A549细胞的生长。
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