摘要
近年来结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）的死亡率有所下降，主要归因于早期筛查及治疗方式的改革，但其发病率仍居全球第三、死亡率居全球第二。有研究发现肠道菌群的改变以及肿瘤细胞中胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase,CBS）的表达上调，可引起结肠癌细胞中硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）含量升高，也有研究称细胞内硫化氢产生酶CBS具有负向调节铁死亡的功能，但H2S在结直肠癌中发挥的作用及机制尚不明确。H2S作为一个潜在的结直肠癌治疗新靶点，阐明其作用机制并研发相应药物对结直肠癌的治疗具有重要临床意义。随着纳米医学技术的发展及纳米材料本身具备的治疗特性，应用合适的纳米材料或许能够有效调控肿瘤中H2S含量，从而抑制结直肠癌进展。因此，本研究旨在制备能够与硫化氢反应的纳米材料HmZnO，并在体内外证实HmZnO通过调控铁死亡信号通路抑制结直肠癌的作用。 目的与方法： 为探索H2S在结直肠癌中的含量及其生物学作用，利用Unisense电极检测结直肠癌组织标本和结直肠癌细胞系中H2S的含量；利用Western blot和免疫组化染色检测CBS在结直肠癌组织标本和细胞系的表达；利用MTT和细胞增殖实验检测CBS抑制剂AOAA处理后的结直肠癌细胞生长情况。以氧化锌为基础构建中空多孔的介孔氧化锌纳米材料（Hollow mesoporous zinc oxide nanosphere,HmZnO）；通过DLS、氮气吸附-解吸曲线分析HmZnO的粒径分布、Zeta电位以及介孔形态；并进一步利用浸泡法将FITC负载在HmZnO上构建HmZnO@FITC。利用总谷胱甘肽检测试剂盒检测HmZnO联合右旋糖酐铁（Iron dextran,ID）处理的HCT116和CT26细胞中总谷胱甘肽含量；MTT法测定HmZnO、ID、GSH和铁死亡抑制剂ferrostatin-1（fer-1）处理后HCT116和CT26的细胞活性；为探索H2S诱导结直肠癌细胞死亡的机制，利用Westernblot、透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）、ROS检测试剂盒和BODIPY C11探针证实HmZnO处理后结直肠癌细胞中铁死亡相关分子标志物，形态学特征改变及脂质ROS水平的变化；最后利用转录组测序探索经HmZnO处理的HCT116细胞的转录组水平变化。为验证HmZnO动物实验的可行性，我们通过体内荧光成像及定量分析，对CT26原位结肠癌模型小鼠静脉注射HmZnO@FITC后进行体内成像及肿瘤摄取定量分析；利用血常规、生化和肝肾功能水平检测静脉注射HmZnO对免疫功能正常小鼠的影响。进一步检测HmZnO在原位肿瘤模型中的作用，利用活体荧光观察小鼠原位盲肠肿瘤模型经HmZnO治疗后小鼠原位肿瘤的变化；利用Western blot观察小鼠肿瘤经HmZnO治疗后分子表达水平改变；利用Unisense电极检测小鼠肿瘤经HmZnO治疗后H2S含量改变。 结果： 1.内源性H2S在结直肠癌中的含量及其生物学作用 本研究发现H2S含量、胱硫氨酸-β-合成酶（CBS）表达水平在结直肠癌中均显著上调，同时利用AOOA抑制CBS发现不仅可以显著降低结直肠癌细胞内H2S含量，还可以有效抑制肿瘤细胞生长和细胞活力。 2.介孔氧化锌空心纳米球（HmZnO）的制备及表征 本研究成功合成一种粒径均匀的纳米材料HmZnO并对其进行表征发现，HmZnO是一种粒径约为203nm，比表面积为241m2/g，中位孔径为3.23nm的理想介孔纳米材料，通过检测HmZnO的硫化分解作用并对其表征证明HmZnO具有高效清除H2S作用，最后利用浸泡法成功构建荧光纳米材料HmZnO@FITC，以便后续的体内观察。 3.HmZnO通过清除H2S诱导结直肠癌细胞铁死亡 本研究发现HmZnO清除H2S后结直肠癌细胞内总谷胱甘肽（GSH）水平下调，并显著降低结直肠癌细胞的活性，并且结直肠癌细胞内ROS水平上调；结直肠癌细胞中线粒体发生皱缩并且嵴数量减少，脂质过氧化物在细胞内堆积，铁死亡相关因子改变，比如GPX4显著下调、COX2、NOX1、TFR1显著上调；对经HmZnO处理的HCT116细胞进行转录组测序发现有谷胱甘肽合成代谢通路相关分子（GGCT、RRM1和RRM2）的改变。 4.HmZnO在原位肿瘤模型中的抑制作用 本研究成功构建体内盲肠原位肿瘤模型并证实HmZnO@FITC主要在小鼠肝脏和肿瘤部位富集，并通过检测经HmZnO静脉注射后免疫正常小鼠的血常规、生化和肝肾功能证明HmZnO对免疫正常小鼠没有明显毒性；HmZnO联合ID治疗可有效降低小鼠瘤体中H2S含量，并抑制肿瘤生长。 结论： 1.内源性H2S含量在结直肠癌中增高。 2.HmZnO具有较好的安全性和生物相容性，并且能够高效清除结直肠癌中的H2S。 3.HmZnO和ID联用可诱导结直肠癌细胞发生铁死亡，从而在体内外模型中抑制结直肠癌进展。
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