摘要
1、目的： 春砂仁为姜科植物阳春砂Wurfbainia villosa（曾用名：Amomum villosum）的干燥成熟果实，为岭南道地药材之一。果实富含的乙酸龙脑酯是其在中国药典的主要药效成分和质量指标。前期研究已经从阳春砂中克隆并鉴定了龙脑基二磷酸合酶（bornyl diphosphate synthase，BPPS），该酶的间接产物龙脑是乙酸龙脑酯的直接前体；龙脑乙酰基转移酶（borneol acetyltransferase，BAT）催化龙脑生成乙酸龙脑酯，因此，BAT是阳春砂乙酸龙脑酯合成途径下游的最后的关键酶。BAT属于BAHD酰基转移酶基因家族中的醇乙酰基转移酶（alcohol acetyltransferase，AAT），然而，目前BAT基因还未被发现。本研究基于阳春砂基因组和转录组挖掘BAHD酰基转移酶基因家族，从中筛选候选基因并进行克隆和功能鉴定，以期获得以龙脑为特异底物的WvBAT，解析阳春砂乙酸龙脑酯的生物合成途径，加深对阳春砂乙酸龙脑酯和其它萜酯类合成机制的认识。 2、方法： 2.1基于阳春砂基因组和转录组的BAHD酰基转移酶家族的鉴定 通过已构建的阳春砂基因组数据库的注释和序列信息，以及检索的国内外已报道的BAHD酰基转移酶家族成员，在Pfam蛋白数据库检索其对应的隐马尔可夫模型（hidden Markov models，HMM），由此鉴定对应注释基因，同时以检索“alcohol acetyltransferase”注释的基因作为补充筛选，并在转录组数据中进行本地blast，然后以是否具备保守motif和全长开放阅读框为筛选条件，筛选出阳春砂的BAHD酰基转移酶家族，进行生物信息学分析。 2.2参与龙脑合成的醇乙酰基转移酶基因的筛选、克隆与功能鉴定 比较阳春砂BAHD酰基转移酶家族中可能参与的挥发性酯类合成的WvBAHD在其转录组中的表达量TMP，关注在乙酸龙脑酯所富集的种子团中高表达的基因，筛选AAT候选基因。以候选基因表达量较高的组织部位cDNA为模板进行基因克隆，采用原核表达体系进行融合蛋白诱导与表达，纯化后的蛋白用阳春砂内源底物（以龙脑构型底物为主）进行体外酶促反应，GC-MS检测其催化产物，对可催化龙脑构型底物者命名为WvBAT。 2.3阳春砂中内源龙脑和WvBPPS酶促产物龙脑的光学构型确定 采用有机溶剂超声提取法，用正己烷提取阳春砂种子团中的挥发性萜类化合物，同时对前期获得的WvBPPS进行酶促反应，以手性柱CycloSli-B，用GC-MS对上述萜类提取物和酶促产物中的龙脑构型进行鉴定。 2.4实时荧光定量PCR 设计用于qPCR的引物，以阳春砂不同组织部位的根状茎、叶、花和果实（不同发育时期的果皮和种子团）的cDNA为模板进行qRT-PCR，基因表达水平以2-△△CT进行归一化处理。 2.5WvBAT启动子预测与分析 基于基因组数据，提取相关WvBAT开放阅读框5’端的上游2000bp序列，并分析启动子预测区域中的顺式作用调控元件。 3、结果： 3.1阳春砂BAHD酰基转移酶基因家族的鉴定和候选WvAAT基因的筛选 以BAHD家族成员对应的HMM PF02458，以及“alcohol acetyltransferase”所对应的HMM PF07247，从阳春砂基因组中鉴定了64个WvBAHD基因。上述64个WvBAHD与Arabidopsis thaliana和Malus domestica的BAHD家族成员，以及14个来自不同植物的AAT，它们聚类到8个不同的亚家族，其中已报道的参与挥发性酯类合成的AAT成员主要聚类到分支Ⅰ，基于“PF07247”筛选的基因单独形成一新分支Ⅵ。基于上述分支中的WvBAHD与WvBPPS的共表达分析结果，选定12个WvAAT作为候选基因。 3.2WvAAT候选基因的克隆及功能鉴定 3.2.1WvAAT候选基因编码区全长序列的克隆及其编码蛋白性质分析 本研究成功克隆了其中12个WvAAT候选基因，且均构建了双His标签的pET32a原核表达载体。绝大多数候选基因基本符合BAHD酰基转移酶家族分子量大小；经跨膜功能预测，所有候选WvAAT均符合BAHD家族是胞质酶的特征；同源进化分析中，除PF07247注释基因外，PF02458注释基因与其它已报道的AAT表现出较近的遗传距离，提示该类基因编码的蛋白性质更接近于AAT。 3.2.28个候选WvAAT鉴定为WvBAT 通过原核表达和分离纯化，获得12个候选WvAAT融合蛋白。其中8个候选WvAAT均被鉴定为WvBAT。8个WvBAT均能催化（-）-龙脑产生（-）-乙酸龙脑酯，其中5个还可催化异龙脑产生乙酸异龙脑酯。另外有5个WvBAT可催化（+）-龙脑产生（+）-乙酸龙脑酯，其中WvBAT3和WvBAT4对（+）-龙脑有较好的催化活性。此外，WvBAT3还可催化α-萜品醇合成α-乙酸萜品酯。 3.3阳春砂中的内源龙脑与WvBPPS酶促产物龙脑均为（+）-龙脑 鉴定阳春砂种子团中的内源龙脑以及在WvBPPS酶促反应中产生的龙脑的手性构型均为（+）-龙脑，且含量以（+）-龙脑最为丰富，（+）-异龙脑次之，不含（-）-龙脑。这表明（+）-龙脑是阳春砂合成乙酸龙脑酯的唯一内源底物。 3.4WvBAT表达模式与萜类产物的相关性分析 WvBAT在不同发育期种子团和不同组织部位中表达量分析的结果表明，WvBAT6、WvBAT3和WvBAT4的表达模式均表现为种子特异性表达，并且与WvBPPS相似，即都在45-DAF的种子团中高表达；然而，只有WvBAT3和WvBAT4能催化（+）-龙脑和异龙脑，与阳春砂种子中的内源底物相符，表明WvBAT3和WvBAT4应是主要负责种子团中乙酸龙脑酯和乙酸异龙脑酯合成的两个关键酶。 3.5WvBAT的启动子顺式作用元件分析 8个WvBAT基因的启动子均含有响应茉莉酸甲酯和脱落酸的顺式作用元件，推测WvBAT的表达可能受非生物胁迫的诱导。除了WvBAT5外，所有WvBAT启动子都含有与种子表达相关的顺式作用元件。 4、结论： 本研究首次鉴定了阳春砂的BAHD酰基转移酶基因家族，并首次报道了阳春砂的WvBAT基因，8个WvBAT均能催化至少一种龙脑构型底物与乙酰辅酶A催化生成相应构型的乙酸龙脑酯。本文首次通过手性柱鉴定了阳春砂传统药用部位果实中的内源龙脑是右旋构型，WvBAT3和WvBAT4对（+）-龙脑具有较好的催化活性，且在种子中特异表达，特别是在45-DAF种子有较高的表达，推测WvBAT3和WvBAT4是参与阳春砂种子团中乙酸龙脑酯合成的两个关键BAT。本文首次鉴定了阳春砂的药用指标成分乙酸龙脑酯的生物合成通路最后一步的关键酶，为全面了解阳春砂其它萜酯类的代谢途径奠定基础，同时为挖掘其它药用植物中的BAT提供借鉴。
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