摘要
目的： 阿尔茨海默病患病率高且难以治愈，慢性应激可能通过多种方式诱导或加重AD病情。课题组前期从缓解应激损伤入手，结合中医脑病肝治理论，将逍遥散作为代表方，从体外细胞和模型大鼠两方面进行探究，发现该方可有效缓解模型大鼠行为学表现、改善体外模型细胞损伤，且低极性石油醚部位药理作用较佳。本研究在前期基础上，一方面尝试建立慢性应激复合AD小鼠模型，证实逍遥散对模型的药理作用，筛选干预剂量。另一方面尝试以超临界CO2提取技术优化该方低极性组分提取工艺，测定提取物特征成分并初步建立特征图谱。同时，利用模型比较不同方法所得提取物的干预作用，并探究其对FKBPs/GR/BDNF信号通路中相关调控因子的影响，为后续的药物研究奠定基础。 方法： 1.通过对APP/PS1小鼠进行45天连续CUMS刺激，建立慢性应激复合AD小鼠模型。模型建立过程中同步给予不同剂量逍遥散水提液干预，利用SPT、OFT、MWM三种行为学测试、血清Cort测定、HE染色、刚果红染色、免疫组化等检测判断模型建立情况和药物干预作用，同时筛选干预剂量。 2.以逍遥散SFE-CO2提取物的收率、藁本内酯、白术内酯Ⅰ的含量为评价指标，运用均匀设计考察提取过程中不同工艺参数的影响，优选此提取方法的最佳工艺条件。以最优工艺提取十批提取物，运用HPLC和GC-MS测定其中藁本内酯、白术内酯Ⅰ、DL-薄荷醇、苍术酮、姜酮、β-谷甾醇的含量，同时建立特征图谱，考察十批提取物的相似度和整体稳定性。 3.对所建模型分别给予逍遥散水提液、逍遥散石油醚萃取物、逍遥散超临界合并药渣提取物进行干预，对干预后模型进行SPT、OFT、MWM三种行为学测试、血清Cort测定、HE染色、刚果红染色、免疫组化、荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等检测，探究并比较不同方法提取的逍遥散提取物对模型的干预作用，初步探究提取物对FKBPs/GR/BDNF信号通路中相关调控因子的影响。 结果： 1.慢性应激复合AD小鼠模型的建立及逍遥散水提液对模型干预作用的研究。 分别与阴性对照组和APP/PS1组比较，复合模型组小鼠的糖水偏好偏低（P＜0.01），OFT测试中活动时间、中央路程偏低（P＜0.01），MWM测试中站台象限路程较短（P＜0.05），血清Cort浓度偏高（P＜0.01），IHC检测GR阳性表达减少（P＜0.01）。同时，与阴性对照组比较，复合模型组小鼠OFT测试中爬壁站立次数较少（P＜0.05），MWM测试中潜伏期较长（P＜0.01）、站台穿越次数较少（P＜0.01），刚果红染色阳性斑块面积较多（P＜0.01），IHC检测Aβ1-42阳性表达增加（P＜0.01）。 与复合模型组比较，XYS低剂量组糖水偏好增加（P＜0.01），MWM测试站台象限路程增加（P＜0.01），血清Cort浓度偏低（P＜0.01），刚果红染色阳性斑块面积较少（P＜0.01），IHC检测Aβ1-42阳性表达减少（P＜0.01）。XYS中、高剂量组糖水偏好增加（P＜0.01），OFT测试中活动时间、中央路程偏高（P＜0.01），MWM测试中潜伏期较短（P＜0.01）、站台象限路程较多（P＜0.01），血清Cort浓度偏低（P＜0.01），刚果红染色阳性斑块面积较少（P＜0.01），IHC检测Aβ1-42阳性表达减少（P＜0.01），GR阳性表达增加（P＜0.01）。XYS高剂量组OFT测试中爬壁站立次数也明显增加（P＜0.01）。 2.逍遥散超临界CO2提取工艺研究及提取物特征图谱的建立。 均匀设计考察SFE-CO2提取工艺，模型回归性较好，工艺条件影响能力为提取压力＞CO2流量＞提取温度，均为正效应。综合考虑确定最优工艺为提取压力35MPa、提取温度40℃、CO2流量35L?h-1、提取时间3.5h。十批提取物收率为1.33~1.77%。 建立HPLC和GC-MS测定方法，匹配特征图谱。前者识别出129个共有峰，后者识别出23个共有峰并判别化学成分。测定十批样品藁本内酯、白术内酯Ⅰ、DL薄荷醇、苍术酮、姜酮、β-谷甾醇的含量，分别在1.5982~2.3437、0.0467~0.0998、0.0450~0.1835、2.4603~8.9727、0.0915~0.3666、0.1654~3.1390mg?g-1范围内。十批样品与对照图谱的相似度分别在0.975~0.990、0.940~0.994之间，相似度较好。 3.逍遥散不同提取物对慢性应激复合AD小鼠模型的干预作用及机制探究。 分别与阴性对照组和APP/PS1组比较，复合模型组小鼠的糖水偏好偏低（P＜0.01，P＜0.05），OFT测试中活动时间偏低（P＜0.01）、中央路程偏低（P＜0.05）、爬壁站立次数下降（P＜0.01，P＜0.05），MWM测试中站台象限路程较短（P＜0.01），血清Cort浓度偏高（P＜0.01），刚果红染色阳性斑块面积较多（P＜0.01，P＜0.05），IHC检测Aβ1-42阳性表达增加（P＜0.01，P＜0.05），GR阳性表达减少（P＜0.01），荧光定量PCR检测GR、BDNF的mRNA相对表达减少（P＜0.05，P＜0.01），FKBP5的mRNA相对表达增加（P＜0.01，P＜0.05），蛋白免疫印迹实验GR、FKBP4蛋白表达减少（P＜0.01），FKBP5蛋白表达增加（P＜0.01）。同时，与阴性对照组比较，复合模型组小鼠MWM测试中潜伏期较长（P＜0.01）、站台穿越次数较少（P＜0.01），荧光定量PCR检测APP的mRNA相对表达增加（P＜0.01），FKBP4的mRNA相对表达减少（P＜0.01），蛋白免疫印迹实验BDNF蛋白表达减少（P＜0.01）。 与模型组比较，XYS水提液组、石油醚萃取物组、超临界提取物组的糖水偏好偏高（P＜0.01），OFT测试中活动时间较长（P＜0.01），MWM测试中潜伏期较短（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）、站台象限路程较长（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），血清Cort浓度偏低（P＜0.01），刚果红染色阳性斑块面积较少（P＜0.01），IHC检测Aβ1-42阳性表达减少（P＜0.01），GR阳性表达增加（P＜0.01），荧光定量PCR检测APP、FKBP5的mRNA相对表达减少（P＜0.01），GR的mRNA相对表达增加（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），BDNF的mRNA相对表达增加（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），蛋白免疫印迹实验BDNF、GR、FKBP4蛋白表达增加（P＜0.01），FKBP5蛋白表达减少（P＜0.01）。同时，超临界提取物组在OFT测试中爬壁站立次数增加（P＜0.01），在MWM测试中站台穿越次数增加（P＜0.05），荧光定量PCR检测中FKBP4的mRNA相对表达增加（P＜0.01）。 结论： 本研究建立了慢性应激复合AD小鼠模型，证实逍遥散水提液可有效缓解该模型损伤，且高剂量效果最佳。同时尝试对逍遥散低极性组分进行工艺优化，确定逍遥散超临界CO2提取的最优工艺，并初步建立提取物的HPLC、GC-MS特征图谱，测定其中6种成分含量，提取物整体较稳定。探究不同提取物对所建立模型的干预作用，逍遥散水提液、石油醚萃取物、超临界合并药渣提取物均表现出较好的药理效果，超临界合并药渣提取物效果最佳。逍遥散对模型的干预作用可能是通过降低FKBP5的表达，升高FKBP4、GR、BDNF的表达，即影响FKBPs/GR/BDNF信号通路中的相关调控因子实现的。
NETL