摘要
目的: 脓毒症是危急重症的常见并发症，且死亡率居高不下，严重威胁人类健康。急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是脓毒症最常见的并发症之一，大量炎症因子的释放与肺脏组织损伤程度密切相关，但其免疫调控过程及炎症因子的级联反应尚未完全明确。既往研究发现白介素17A（Interleukin-17A，IL-17A）在宿主抵抗病原体感染中发挥重要作用，其水平在脓毒症患者血液中显著上调，可改善患者预后。近年来发现一些先天性免疫细胞，如2型固有淋巴细胞（group2innate lymphoid cells，ILC2s），γδT细胞等，也可分泌IL-17A并在宿主抵御粘膜感染的过程中发挥重要作用。然而，ILC2s及IL-17A在脓毒症ALI时的调控因素及作用机制仍未完全被阐明。ILC2s的神经系统调控是近年来的研究热点，在脓毒症ALI中神经介素是否参与调控ILC2s却尚未完全阐明。因此，本课题拟深入探究脓毒症模型中肺脏组织中ILC2s及IL-17A的表达变化情况及其调控机制，以阐述脓毒症的炎症级联反应，为发现脓毒症的治疗靶点提供一定的理论依据。 方法: 本研究采用盲肠结扎穿孔手术（Cecal ligation and puncture，CLP）诱导野生型（C57BL/6J）小鼠脓毒症模型。在CLP后特定时间点分别提取小鼠肺脏组织，采用流式细胞术及实时荧光定量PCR等方法检测ILC2s、γδT细胞、IL-17A、神经介素U（Neuromedin U，NMU）和1型NMU受体（NMUR1）的表达水平。分选小鼠肺脏组织ILC2s与γδT细胞进行离体共培养，测定共培养系统中的γδT细胞数量和IL-17A表达变化。为野生型小鼠注射外源性NMU，再检测ILC2s、γδT细胞及IL-17A的表达变化。为明确NMU对ILC2s及γδT细胞下游的调控作用，利用CRISPR/Cas9法下调ILC2s表达的nmur1基因的表达，再将其与肺脏γδT细胞共培养并给予NMU刺激，检测γδT细胞及IL-17A的表达变化。为明确ILC2s所释放的IL-9对γδT细胞的作用，采用CRISPR/Cas9技术下调ILC2s表达的Il-9基因，再测定共培养系统中的γδT细胞数量和IL-17A浓度变化情况。 结果: 脓毒症模型肺脏组织中IL-17A的蛋白质及mRNA水平均显著上调，流式细胞学检测结果表明ILC2s及γδT细胞的细胞数及比例均明显上调。进一步分析发现，γδT细胞是脓毒症模型中肺脏组织IL-17A的主要来源。而将肺脏ILC2s和γδT细胞进行离体共培养时发现，ILC2s可以上调γδT细胞数量，并促进后者分泌IL-17A，提示ILC2s可能通过调控γδT细胞发挥下游免疫作用。此外，也检测到脓毒症肺脏中NMU的表达显著上调，ILC2s所表达的nmur1也明显上调。肺脏nmur1特异性表达于ILC2s而不表达于γδT细胞。在给小鼠腹腔注射NMU后，肺脏ILC2s、γδT细胞及其分泌的IL-17A均出现显著升高；而在ILC2s和γδT细胞的离体共培养模型中也得到了类似的结果。通过CRISPR/Cas9技术下调特异性表达于ILC2s的nmur1基因后，发现NMU通过ILC2s对γδT细胞的刺激作用明显受到抑制，以上结果提示NMU通过与表达于ILC2表面的NMUR1结合，发挥下游调控作用。为进一步明确ILC2s对γδT细胞的调控机制，将肺脏ILC2s和γδT细胞进行离体共培养，并予以NMU外源性刺激，发现ILC2s可分泌大量的IL-9。进一步以CRISPR/Cas9技术特异性敲除ILC2s所表达的Il9基因后，再将该细胞与γδT细胞共培养，研究发现ILC2s对γδT细胞及IL-17A的上调作用均明显受到抑制。 结论: 研究发现脓毒症肺脏组织中NMU表达显著上调，NMU通过结合NMUR1特异性刺激ILC2s，进而刺激γδT细胞的活化。进一步发现，ILC2s通过分泌IL-9而上调γδT细胞表达，继而促进IL-17A的分泌。该研究首次证实了脓毒症中伴随以NMU为代表的神经免疫调控轴的变化，并揭示了固有免疫淋巴细胞在脓毒症中的重要作用。
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