摘要
日益严峻的环境污染与疾病的发生发展密切相关，各污染物之间存在迁移、转化和交互影响等过程，容易造成次生环境胁迫问题(如环境缺氧)，对生态环境和生命健康产生威胁。然而，对于缺氧胁迫如何干扰正常的生理过程，以及内源性生物活性物种如何修复这些情况，目前还不清楚。荧光成像技术因其灵敏度高、选择性好以及原位分析等优点，可以对分析物实现无损、实时、高时空分辨率监测，已广泛应用于化学生物学、环境科学、医学成像等领域。本研究借助荧光成像技术，采用新型花菁类荧光探针作为分析检测工具，对环境缺氧胁迫下内源性活性硫物种(RSS)中的生物硫醇(谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸(Cys))、多硫化氢(H2Sn)、二氧化硫(SO2)及其衍生物的波动以及缺氧胁迫下活性氧(ROS)的水平波动进行原位监测和成像，以评估这些生物活性分子在缺氧相关损伤和疾病中的生理和病理学功能，从分子层次上揭示环境与健康之间的关系。本文具体研究内容如下: 1.近红外荧光探针用于脑缺血再灌注胁迫下内源性谷胱甘肽(GSH)检测及其作用评估 脑缺血/再灌注(1/R)常发生在脑卒中等常见疾病中，脑I/R诱导的脑卒中会导致机体缺氧从而引起氧化应激并产生大量ROS。GSH作为生物体内含量最丰富的生物硫醇和抗氧化剂，在细胞内含量高达毫摩尔浓度，其内源性含量的变化能够反映细胞内的氧化还原状态，并且GSH的抗氧化性质在细胞和组织以及体内的脑I/R过程中具有重要作用。为了探索脑缺血再灌注胁迫下内源性GSH的变化，我们基于新型荧光团BCy-Keto，设计并合成了两种独特的“关-开”型近红外荧光探针BCy-SeSe和BCy-SS，用于实时成像和评估脑I/R过程中细胞和活体内线粒体GSH。探针由两个部分组成:近红外荧光I羽BCy-Keto和IGSH特异性识别基团(二硒键或二硫键)。探针通过硒硫或硫硫交换裂解二硒键或二硫键，随后发生分子内环化释放荧光团。探针的双电荷性质使其具有线粒体靶向定位功能，探针对线粒体内GSH具有高选择性和灵敏性，并表现出“开型”荧光响应。细胞I/R模型和小鼠大脑中动脉栓塞模型研究结果显示，内源性GSH的原位荧光成像揭示了细胞I/R损伤和腑梗与GSH水平下降有密切关系，证实了GSH在I/R过程中对大脑有保护作用。该探针为研究脑I/R胁迫下生理和病理损伤机制及I/R损伤的预防和干预提供了可视化研究工具。 2.可视化成像与评估缺氧再灌注(H/R)胁迫下细胞、组织和活体内内源性半胱氨酸(Cys) Cys作为另一种生物硫醇，既是能指示机体健康状态的生物内源性代谢产物，又是生命系统中重要的生物活性分子，与GSH在复杂的生物系统中相互关联。基于前期对脑缺血蒋灌注胁迫下GSH抵抗缺氧损伤的生物学效应研究，本工作设计了一种用于检NCys的荧光探针BCy-AC，并评估Cys在环境H/R胁迫下的生物功能。探针由识别基团丙烯酸酯和近红外荧光团BCy-Keto组成，荧光团BCy-Keto独特的烯醇-酮互变异构提高了探针的灵敏度和潜在的应用性能。探针表现出良好的线粒体定位功能，具有近红外特性、组织穿透性和原位可视化等特点。小鼠海马神经元HT-22细胞、斑马鱼和小鼠海马组织qbCys的可视化成像结果发现，探针BCy-AC可以作为环境缺氧胁迫下Cys水平监测的有效手段。利用BCy-AC可以评估Cys浓度与H/R诱导的损伤之间的联系，从而发现Cys能防御环境H/R诱导的线粒体相关损伤。因此，研究Cys在缺氧环境胁迫下的波动和生物效应评估，为寻找抵御环境胁迫损伤的有效方式提供了依据。 3.近红外荧光探针用于原位观察缺氧胁迫下细胞和体内H2S的形成和波动 多硫化氢(H2Sn，n＞1)是RSS中的一种，具有保护细胞以及信号传导的作用，在生物体内可以通过GSH和Cys在内的生物硫醇和蛋白质氨基酸残基的多硫化和过硫化代谢产生，第三类气体信号分子H2S在酶促作用下与ROS作用也可内源性生成H2Sn。缺氧胁迫可扰乱细胞氧化还原平衡和内稳态，复杂的生物系统中各种活性分子之间互相制衡、调控，H2Sn在生物系统中连接多种RSS和ROS，在缺氧胁迫下的形成和波动对于细胞和活体的缺氧损伤研究具有重要意义。本工作中我们设计了一种近红外探针BCy-FN，用于原位观察缺氧胁迫下细胞和斑马鱼体内线粒体硫氰酸(HSNO)介导的H2Sn的形成。探针由近红外花菁荧光团BCy-Keto和2-氟-5-硝基苯甲酸识别基团组成，具有线粒体定位的特点。探针成本低，对H2Sn具有较高的选择性、灵敏度和响应速率。在斑马鱼ZF4细胞和斑马鱼H/R模型中，探针BCy-FN成功应用于H2Sn的原位成像以及HSNO介导的H2Sn生成。结果表明，HSNO介导的H2Sn能在一定程度上抵抗缺氧胁追造成的损伤。小鼠腹腔成像结果表明，探针具有良好的近红外特性，可以进行无损原位可视化成像。探针BCy-FN在斑马鱼活体内的实时成像可用于辅助评估缺氧过程中的氧化应激状态，有助于更好地了解缺氧胁迫下HSNO介导的H2Sn形成对缺氧损伤的生物学效应，BCy-FN为未来探索HSNO介导的H2S。生成和它们在生物系统中的研究提供了有力的工具。 4.H2Sn荧光探针特异性识别基团的新发现 活性硫物种作为一类关键的抗氧化剂和生物信号分子，参与调节机体氧化还原平衡和内稳态。目前对H2Sn荧光探针的研究主要集中在改变荧光团或提高探针的性能上，而较少报道H2Sn荧光探针新的特异性识别基团。本工作基于硝基取代的苯酚、4-羟基苯乙酮、对溴苯酚、对甲氧基苯酚、对二甲氨基等不同取代基的苯酚，制备了6个以2，4-二硝基苯为识别基团的简单化合物，构建了用于识别H2S。的小分子库，验证了2，4-二硝基苯基团对H2S。的特异性响应。结果表明，苯酚上取代基的吸电子效果越强，对H2Sn的响应越好。基于香豆素荧光团，我们设计合成了荧光探针7，对研究结果进行验证。本研究为H2S。的研究和H2Sn荧光探针的开发提供了一个新的潜在的候选位点。 5.超灵敏荧光探针可视化观察SO2及其衍生物在生命系统中的代谢 SO2及其衍生物既是环境污染物也是广泛使用的食品添加剂，同样也是生命系统中含硫物质的代谢产物，其在亚硫酸盐氧化酶作用下可形成水溶性硫酸盐随尿液排出体外，维持生物硫平衡。内源性SO2可以通过GSH在酶催化作用下产生，也可通过H2S在内的多种含硫物质的相互转化生成，多以HS03-和S032-的形式存在。然而，由于缺乏有效的检测工具，SO2及其衍生物在许多生理和病理过程中的生成和代谢的分子机制尚不清楚。本工作中，我们设计了一种超灵敏的荧光探针MS-Bindol，用于识别和检测SO2及其衍生物，阐明了RSS在生物系统中的密切关联和相互转化过程对生理病理机制的作用。该探针具有斯托克斯位移大、线粒体定位、水溶性好、响应速度快、检测限低(0.2nM)等优点，能对水溶液中SO2及其衍生物和空气中的SO2进行敏感响应。细胞和斑马鱼中SO2衍生物的原位可视化成像结果表明，SO2衍生物可以由硫代硫酸盐幂NGSH合成，并且当铁氰化物或亚砷酸盐抑制SO2衍生物代谢所需亚硫酸盐氧化酶时，细胞和斑马鱼体内的SO2衍生物不容易被代谢而出现累积。此外，探针MS-Bindol在食品和环境水样等实际样品中对SO2衍生物的检测方面表现出良好应用前景。该探针将成为一种有效的高灵敏传感器工具，用于监测细胞、活体、食品、环境水样中的S02衍生物。 6.用于过氧化氢(H2O2)检测的荧光探针在缺氧胁迫下的原位成像分析 在缺氧胁迫引起的损伤和复杂生理、病理性变化过程中，不仅各种RSS水平随之波动，ROS也会受到显著影响。内源性ROS水平与氧化还原平衡和GSH、Cys等生物硫醇以及其他抗氧化剂的活性与浓度等都有着密切的关系。H2O2是一种参与细胞中多种生理过程的重要ROS，正常情况下，H2O2受到精确调控，可激活细胞内信号转导通路，促进细胞增殖和分化。但作为氧化应激的来源，H2O2的异常表达会攻击细胞内的生物分子，与DNA损伤、衰老、癌症、心血管和神经退行性疾病等都有关。在本研究中，我们通过将4-(甲基亚砜)苯基与苯并吲哚偶联形成碳-碳双键，设计了比率荧光探针MSO-Bindol，用于观察细胞和斑马鱼在多种氧化应激刺激和环境胁迫尤其是缺氧胁迫下H2O2的波动。我们利用该探针研究了氧化应激和缺氧胁追下生物系统中H2O2的波动，揭示了LPS、PMA和Hg2+诱导的氧化应激与活细胞和斑马鱼体内H2O2上调之间的关系，并构建了不同缺氧程度的细胞和斑马鱼缺氧胁迫模型，探索缺氧时间诱导的H2O2变化情况。实验结果表明，缺氧胁迫诱导的H2O2上调可能是ROS爆发的一个体现，缺氧损伤的原因可能与H2O2直接相关，H2O2的爆发在一定程度上造成了细胞氧化应激损伤，本工作为研究环境缺氧胁迫的损伤机制和H2O2的监测提供了一种新的途径和思路。
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