摘要
花青素是广泛存在于自然界中的一类植物次级代谢产物，属于类黄酮大家族的成员。它的存在使植物呈现出五彩斑斓的颜色，因其强大的抗氧化属性而具有抗衰老、预防心脑血管发生等多种对人类有益的保健功能，越来越受到人们的重视。植物中花青素的生物合成受到R2R3MYB、bHLH、WDR三类调控因子的调控，它们通过形成MBW复合物而对结构基因的转录进行调节。目前这三类调控因子在拟南芥、玉米、矮牵牛等模式植物中的调控机制已经相对清楚，但在水稻等植物中的研究还不够成熟。 已有的研究表明水稻花青素的合成具有组织差异性。目前叶子中花青素代谢途径的调控已有进展，但颖果中花青素合成的调控机制研究还非常有限，已经鉴定的MYB(如OsC1)不足以解释颖果花青素的积累模式。本研究以有色水稻种子作为主要材料，通过总结前人的研究工作，对可能参与水稻颖果中花青素合成的调控因子进行了系统的功能分析，试图通过一系列的实验证据来揭示调控水稻颖果中花青素合成的主要参与成员及其机制。本研究获得的主要进展如下: 1.通过设计特异引物，以30个有代表性的水稻品种为研究材料，对花青素代谢途径7个结构基因(OsCHS、OsCHI、OsF3H、OsDFR、OsF3''H、OsANS、Os3GT)和调控基因(OsC1、OsMYB3、OsB1、OsB2、OsB3和OsPAC1)在编码区和启动子区序列的多态性进行了分析。结果发现，除了OsMYB3、OsB2和OsB3外，其他基因中都发现了多条等位基因，不同等位基因在编码区的变异多以单核苷酸的替换为主，而启动子区则出现了大量碱基的插入和删除，一些等位基因在编码区的变异引起了功能的改变。 2.本研究发现了两个参与水稻颖果中花青素代谢途径的MYB类转录因子(OsMYB3、OsMYB4)和一个bHLH转录因子(OsB3);基因表达模式分析表明OsMYB3、OsMYB4、OsB2、OsB3都在水稻开花后有较高表达，授粉后5天的种子中达到高值，授粉10天后表达量急剧下降，推测这四个调控基因可能参与水稻颖果中花青素的合成，而OsC1和OsB1则主要在叶片中表达。 3.通过酵母双杂交实验和双分子荧光互补试验对几个主要的MYB和bHLH转录因子的互作关系进行了分析，结果表明OsB1、OsB2和OsB3分别能够与MYB类转录因子OsMYB3、OsMYB4和OsC1互作，同时也能够和WDR类调控因子OsPAC1互作。瞬时转化实验结果表明，OsMYB3、OsMYB4、OsB2、OsB3都能够一定程度地单独激活花青素代谢途径结构基因CHS和DFR的启动子，而当OsMYB3、OsMYB4分别和OsB1、OsB2、OsB3中的任何一个因子以及OsPAC1共同作用时，能够显著激活结构基因(OsCHS、OsDFR、OsF3H、OsF3''H和OsANS)的启动子，同时对OsCHI和Os3GT的启动子也有一定的弱激活。OsMYB3与三个bHLH转录因子和OsPAC1对结构基因启动子的激活作用大于OsMYB4。酵母单杂交实验结果表明OsMYB3能够激活OsF3''H和Os3GT基因的启动子。 4.通过凝胶阻滞实验对花青素代谢途径结构基因启动子上的MRE和BRE进行了分析。结果表明结构基因启动子区存在着丰富的BRE和MRE，BRE在序列结构上与文献报道的CACN(A/C/T)(G/T)规律一致，MRE除了ANCNNCC形式外，第六位的碱基可以是A、G或T。OsMYB3、OsMYB4、OsB1、OsB2和OsB3能够识别并结合到这些cis元件上，从而对结构基因的转录进行调控。 本研究为水稻颖果中花青素代谢途径的调控提供了机制上的解释。OsMYB3和OsMYB4是两个功能冗余的MYB转录因子，可能以OsMYB3/OsMYB4-OsB2/OsB3-OsPAC1复合物的形式调控水稻颖果中花青素的合成。其中，OsMYB3的作用更为主要。
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