摘要
研究目的: 细胞自噬功能紊乱是帕金森病(PD)发病的重要病理机制，本论文重点研究小胶质细胞自噬缺陷对脑内神经炎症及PD病理过程的影响。 研究方法: 首先，构建以Synapsin为启动子载入人源性SNCA(α-synuclein编码基因1的重组腺相关病毒(AAV2/9-hα-syn)，通过脑立体定位注射至小鼠黑质建立PD模型，对照注射AAV2/9-GFP。注射后不同时间(2、4、8周)以免疫印迹检测组织裂解液中hcz-synuclein(hα-syn)表达:免疫组化观察病毒表达效率、分布、以及主要感染细胞类型，明确PD模型是否成功构建。其次，Lyz2cre工具鼠与Atg5fllox/flox小鼠交配繁育获得小胶质细胞自噬相关基因Atg5缺陷小鼠(Lyz2cre;Atg50flox/flox,cKO)，对照为同窝Atg5flox/flox(WT)小鼠;另外，新生鼠分离培养WT与cKO原代小胶质细胞。免疫印迹检测组织及原代小胶质细胞Atg5和其他自噬相关蛋白表达验证小胶质细胞Atg5敲除效率。然后，将AAV2/9-hα-syn或AAV2/9-GFP病毒注射至WT、cKO小鼠黑质，免疫印迹检测黑质自噬相关蛋白LC3和p62蛋白水平的改变，免疫组化检测小胶质细胞标志物Iba1和D62阳性染色，定量PCR检测黑质炎症因子mRNA水平。同时，离体实验以原代小胶质细胞加入α-syn单体处理6h，检测蛋白LC3和p62的表达水平，分别以ELISA和定量PCR测定上清与细胞内IL-1β等细胞因子的含量及转录水平。另外，分别取幼龄(2月龄)和老龄(12-15月龄)的WT与cKO小鼠，以免疫荧光染色研究小胶质细胞标志物Iba1和星形胶质细胞标志物GFAP表达。病毒注射后八周，免疫荧光观察pS129-α-syn阳性斑点;免疫印迹检测pS129-α-syn水平、以及α-syn病理性聚聚集;免疫组化检测酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性神经元及纤维密度，以及多巴胺能转运体(DAT)表达改变。以旷场检测小鼠自主运动，转棒检测运动协调能力;高架十字迷宫检测诱发性焦虑，悬尾检测抑郁样症状;以嗅觉偏好和灵敏度检测评价小鼠嗅觉功能。 研究结果: 1.AAV2/9-hα-syn介导的α-syn主要表达于黑质部位神经元 AAV2/9-hα-syn黑质定位注射后两周可以检测到hα-syn蛋白，且表达水平随时间延长而逐渐增加，8周时保持较高水平表达，约为2周的2倍。AAV2/9-GFP组无hα-syn蛋白表达;而且，GFP或hα-syn阳性染色主要与神经元标志物(NeuN)共定位，与小胶质细胞(Iba1)或星形胶质细胞(GFAP)几乎无明显共定位。 2.小胶质细胞Atg5条件性敲除小鼠脑内存在自噻缺陷 与WT小鼠相比，cKO小鼠黑质组织中Atg5及LC3-Ⅱ蛋白水平降低，伴随D62蛋白增加，而Beclin1和Atg7自噬相关蛋白无明显改变。分别从新生的WT与cKO小鼠分离原代小胶质细胞，免疫印迹几乎未检测到Atg5蛋白条带，且类似于脑组织结果，LC3-Ⅱ降低而p62升高，说明cKO鼠中小胶质细胞4秽敲除成功。 3.神经元释放的α-syn抑制小胶质细胞自噬 与AAV2/9-GFP相比，AAV2/9-hα-syn注射后腹侧中脑(SN为主)p62蛋白水平升高而LC3-Ⅱ蛋白下降。AAV2/9-hα-syn注射后，与wT小鼠相比，cKO小鼠LC3-Ⅱ进一步下降而p62增加。免疫荧光双染显示AAV2/9-GFP注射的cKO小鼠小胶质细胞含有少量p62斑点，而wT组没有。而在cKO小鼠中，与AAV2/9-GFP相比，AAV2/9-hα-syn组小胶质细胞含有更多的p62斑点，且p62荧光强度增加。经分离培养WT和cKO小鼠原代小胶质细胞，加入α-syn蛋白作用6h，LC3-Ⅱ降低伴随p62蛋白增加;这种改变尤其是p62蛋白增加在Atg5缺失的小胶质细胞中更为明显。 4.小胶质细胞自噬缺陷加剧小胶质细胞激活及脑内炎症反应 病毒定位注射后四周，WT+AAV2/9-GFP组小胶质细胞胞体较小，大多呈分支杆状，而WT+AAV2/9-hα-syn组小胶质细胞胞体明显变大，分枝减少且缩短，整体的Iba1荧光强度也增强;AAV2/9-hα-syn注射组，与WT比cKO小胶质细胞形态改变及整体Iba1荧光强度增加也更为明显，小胶质细胞呈阿米巴样。cKO小鼠与WT小鼠相比(均注射AAV2/9-GFP)，黑质区小胶质细胞形态改变，胞体直径增大、分支减少且缩短。与AAV2/9-GFP注射组相比，AAV2/9-hα-syn注射后WT与cKO小鼠黑质内促炎因子IL-1β和TNF-αmRNA水平均升高;且cKO小鼠中明显高于WT小鼠。此外，AAV2/9-hα-syn注射后，cKO小鼠黑质内CD206转录水平低于、WT组。 与溶剂(PBS)对照相比，无论是wT还是cKO小鼠分离培养的小胶质细胞，加入α-syn均使得促炎因子IL-1β和TNF-α升高;意外的是，抗炎因子IL-10同样升高;与WT小胶质细胞相比，Atg5-/-小胶质细胞中加入α-syn后，上清中IL-1β、TNF-α水平更高，而IL-10未明显改变。定量PCR检测结果与上述细胞因子检测相一致:α-syn促进Wr与Atg5-/-小胶质细胞中IL-1β、TNF-α转录水平升高，伴随CD206转录降低，这种改变在Atg5-/-小胶质细胞中更为显著。这些结果说明自噬缺陷加剧了α-syn诱导的小胶质细胞激活与炎症反应。 5.自噬缺陷小鼠胶质细胞激活随年龄增加而加重 相较于年轻组小鼠(2月龄)，老龄小鼠(12-15月龄)不同脑区小胶质细胞Iba1荧光强度增加，而SN中尤为明显;与老龄WT鼠相比，老龄cKO鼠Iba1和GFAP表达更高，说明自噬和老化双重作用影响了胶质细胞功能。 6.小胶质细胞自噬缺陷促进α-syn蛋白的病理性聚集 免疫染色及免疫印迹显示:AAV2/9-hα-syn注射组cKO小鼠黑质组织中pS129-α-syn蛋白水平显著高于WT小鼠。而且，相较于WT+AAV2/9-hα-syn组，cKO+AAV2/9-hα-syn组中α-syn单体蛋白减少而大分子量寡聚体/聚集体明显增多，这些结果表明小胶质细胞自噬缺陷加速了α-syn的病理性聚集。 7.小胶质细胞自噬缺陷加刷α-syn过表达导致的多巴胺能神经元损伤缺失 与AAV2/9-GFP注射小鼠相比.AAU2/9-hα-syn注射后8周WT小鼠黑质致密部TH阳性神经元丢失约43％，cKO小鼠TH阳性神经元数量缺失达65％。纹状体TH阳性神经纤维密度、以及免疫印迹检测纹状体TH表达结果与之相一致。类似地AAV2/9-hα-syn注射后纹状体多巴胺能转运体(DAT)表达明显减少;与WT小鼠相比，cKO小鼠DAT降低更为显著。 8.小胶质细胞Atg5缺失加重α-syn过表达导致的小鼠自主运动障碍 与AAV2/9-GFP注射相比，AAV2/9-hα-syn注射后8周，WT与cKO小鼠自主运动、运动协调能力明显下降，伴有嗅觉功能减退;与AAV2/9-hα-syn注射的WT小鼠相比，cKO小鼠自主运动障碍更为明显，但运动协调以及嗅觉减退无明显差异。 研究结论: 重组腺相关病毒(AAV2/9-hα-syn)定位注射至小鼠黑质，诱导了黑质纹状体区α-syn过表达和病理性聚集，抑制了小胶质细胞内自噬活性，引起小胶质细胞激活和炎症反应、多巴胺神经元丢失，小鼠出现运动障碍和一些非运动症状(嗅觉减退)。小胶质细胞Atg5条件性敲除加剧α-syn病理性聚集和神经炎症，增加了多巴胺神经元的损伤缺失，从而加重小鼠自主运动障碍。因此，小胶质细胞自噬参与调控脑内炎症，在PD病理过程中发挥重要作用。
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