摘要
高脂高盐摄入与高血压、冠心病、心力衰竭等心血管疾病的发生密切相关，还会导致肾脏组织受损和肾脏功能下降，加重肾脏疾病。此外，适度限钠对慢性肾病（CKD)具有保护作用。乳铁蛋白（Lactoferrin,Lf)是有多种生物学活性的糖蛋白，具有抗炎、抗氧化、抗菌、免疫调节等作用，对肾损伤有调节作用，但具体机制未完全阐明。 目的: 本研究用60％脂肪供能比和不同浓度的高盐（4％和8％)饲料饲喂雄性C57BL/6J小鼠诱导肾损伤，探讨Lf对高盐饮食引起的小鼠血压升高和肾损伤的防治作用。 方法: 实验一:30只3-5周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为3组:（1)对照组（CON，n=10);(2)高脂高盐饮食组（HFS4D，n=10);(3)高脂高盐饮食+乳铁蛋白组（Lf，n=10)。高脂高盐饲料含60％的脂肪供能比和4％NaCl，Lf溶解在蒸馏水中饮水给予，浓度为10mg/mL。实验过程中，每周监测小鼠体重、饮水量和摄食量，每两周测量一次血压。干预20周后使用代谢笼收集随机尿，然后禁食12h,眼睚后静脉丛取血收集血清，小鼠处死后取肾脏等组织用于以下测定。 1.尿液和血清学指标:测定小鼠尿生化指标，包括肌酐、钠（Na+)、总蛋白、微量白蛋白（mALB)和β2-微球蛋白（β2-MG)。测定小鼠血清生化指标，包括肌酐、Na+和尿素氮。 2.肾组织Na++K+-ATP酶活性:试剂盒测定小鼠肾组织该酶活性。 3.肾组织病理学:肾脏HE染色观察肾小管和肾小球病理学改变，计算肾脏病理评分。肾脏Masson染色评估肾间质纤维化程度。 4.肾脏组织中相关mRNA及蛋白表达水平:RT-qPCR检测肾组织中M2巨噬细胞不同亚群标志物CLEC7A和SLAM的mRNA表达水平，Western blotting检测肾组织中炎症和纤维化相关蛋白。 实验二:30只3-5周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为3组:（1)对照组（CON,n=10);(2)高脂高盐饮食组（HFS8D，n=10);(3)高脂高盐饮食+乳铁蛋白组（Lf，n=10)。高脂高盐饲料含60％脂肪供能比和8％NaCl。Lf给予剂量和方法同实验一，实验过程中的处理和样本收集同实验一。干预8周后测定以下指标。 1.尿液和血清学指标:测定小鼠尿中肌酐、Na+和尿蛋白。测定血清中肌酐、Na+和尿素氮。 2.组织病理学指标:肾脏HE染色观察肾小管和肾小球病理学改变，做肾脏病理评分。 3.肾脏中相关mRNA及蛋白表达水平:RT-qPCR检测肾组织中肾素-血管紧张素-酸固酮系统（RAAS)相关指标血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、肾素（Renin)、血管紧张素转换酶（ACE)、ACE2、AngⅡ1型受体（AT1R)及AT2R的mRNA表达水平，Western blotting检测肾组织中诱导型一氧化氮合成酶（iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-1β炎症因子以及NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体的蛋白表达水平。 结果: 实验一: 1.Lf对体重、摄食饮水的影响:20周干预后，HFS4D和Lf组体重均显著高于CON组，Lf组小鼠体重则显著低于HFS4D组（P＜0.05)。3组Na+平均摄入量分别为2.85mg/d、38.76mg/d,35.22mg/d。HFS4D和Lf组饮水量显著高于CON组（P＜0.05)，但这2组间无显著差异。 2.Lf对血压的影响:与CON组相比，HFS4D组小鼠收缩压（SBP)升高8mmHg,Lf组则恢复至CON组水平，但3组间无显著差异;各组间舒张压（DBP)、中心静脉压（CVP)无统计学差异。 3.Lf对Na+排泄的影响:与CON组比较，HFS4D和Lf组小鼠尿Na+含量显著增加（P＜0.05)。FENa+亦有增加，但未达到统计学差异。HFS4D组肾脏Na++K+-ATP酶活性显著低于CON组。因此，高脂高盐未造成小鼠肾脏Na+潴留。 4.Lf对肾功能标记物的影响:与CON组相比，HFS4D组尿中总蛋白量、尿蛋白肌酐比值（UPCr)、mALB和含量显著升高（P＜0.05)，血清尿素氮含量显著降低（P＜0.05);与HFS4D组相比，Lf组小鼠尿中总蛋白、mALB和β2-MG显著降低，血清尿素氮含量显著升高（P＜0.05)。 5.Lf对肾脏病理学的影响:低倍镜(×50)下观察可见HFS4D组肾组织间质结构较为模糊，肾小管内有明显的脂质积累，肾小管空泡化严重，Lf干预后明显改善。高倍镜(×200)下HFS4D组部分小管内可见蛋白管型，炎症细胞浸润;肾小球可见严重的球囊粘连，有不同程度的基底膜增厚，肾小囊壁增厚，且肾小球囊腔内有新月体形成。Lf干预后明显改善。定量分析显示Lf组肾小球纤维化指数及肾脏病理评分（肾小球和肾间质）显著低于HFS4D组（P＜0.05)。 6.Lf对肾脏炎症和纤维化表达的影响:与CON组相比，HFS4D组显著上调了肾脏中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β蛋白以及纤维化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达水平（P＜0.05);Lf干预则显著下调了TNF-α、IL-β1、α-SMA和TGF-β1表达（P＜0.05)。Masson染色显示HFS4D组肾间质纤维面积明显增加，Lf组明显减少（P＜0.01)。 7.Lf对小鼠肾脏不同表型巨噬细胞浸润的影响:HFS4D组F4/80阳性的M1巨噬细胞和CD206阳性的M2巨噬细胞逐渐积累，Lf干预后两种巨噬细胞积累均显著减少（P＜0.05)。M2巨噬细胞不同表型mRNA表达结果显示，在HFS4D组中主要是CLEC7A阳性的M2a巨噬细胞的积累（P＜0.05)，Lf干预可以减少CLEC7A的表达，增加M2c巨噬细胞特征的SLAM的表达（P＜0.05)。 实验二: 1.Lf对小鼠体重、摄食饮水的影响:实验过程中各组小鼠体重平稳增长。干预结束时，HFS8D组和Lf组体重显著低于CON组（P＜0.05)，Lf组体重显著高于HFS8D组（P＜0.05)。3组小鼠摄食量无明显差异。与CON组相比，HFS8D组和Lf组饮水量显著增加（P＜0.05)，且Lf组高于HFS8D组。 2.Lf对血压的影响:HFS8D组SBP升至137.00mmHg,显著高于CON组(P＜0.05);与HFS8D组比较，Lf干预组SBP显著降低了20,83mmHg(P＜0.05)。HFS8D组CVP也显著升高，且Lf组显著低于HFS8D组（P＜0.05)。各组间DBP无明显差异。 3.Lf对RAAS相关指标的调控作用:与CON组相比，HFS8D组的AngⅡ、Renin,ACE、AT1R、ACE2、AT2R的mRNA表达显著升高（P＜0.05)。与HFS8D组相比，Lf组的这4个指标的mRNA表达均显著降低（P＜0.05)。Lf组的ACE2、AT2R的mRNA表达较CON组显著上升（P＜0.05) 4.Lf对肾功能的影响:与CON组相比，Lf组血清尿素氮含量显著减少(P＜0.05)。 5.对肾脏病理的影响:HFS8D组小鼠肾脏切片中主要可见小管内蛋白管型、空泡化和炎症细胞浸润;肾小球有不同程度的球囊粘连，尤其是观察到萎缩肾小球。Lf干预明显改善了小鼠肾脏脂质积累和炎症细胞浸润，肾小管内少见蛋白管型;肾小球球囊粘连程度减轻，少见萎缩肾小球。定量分析显示Lf组肾脏病理总评分以及肾小球和肾间质评分显著低于HFS8D组（P＜0.05)。 6.Lf对NLRP3炎症小体和炎症因子的影响:与CON组比较，HFS8D组显著上调iNOS、TNF-α及IL-6蛋白表达水平（P＜0.05)，Lf干预后其表达水平显著下调（P＜0.05)至CON组水平。与CON组比较，HFS8D组显著上调NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β蛋白表达水平（P＜0.05)，Lf干预后NLRP3、ASC及IL-1β表达水平显著下调（P＜0.05)。 结论: 1.含4％NaCl的高脂膳食后，小鼠尿Na+增加，Na++K+-ATP酶活性降低，未引起钠潴留和血压升高。但是尿蛋白含量增加，血清尿素氮含量降低，并引起以肾间质脂质和炎症聚集，肾小球纤维化和新月体形成为特点的肾脏病理改变，导致与血压无关的肾损伤。Lf干预降低了尿肾小球和肾小管损伤的标志物水平，抑制了肾脏Ml、M2a巨噬细胞、增加M2c巨噬细胞，从而缓解了4％NaCl膳食诱导的炎症和纤维化反应相关的肾损伤。 2.含8％NaCl的高脂膳食后，小鼠SBP和CVP升高，引起肾小球萎缩等肾脏病理损伤和炎症浸润。Lf干预显著降低小鼠SBP和CVP，减轻肾小球萎缩，下调高盐高脂所致小鼠肾脏NLRP3炎症小体和炎症因子的蛋白表达水平，调节RAAS通路相关mRNA的表达水平，预防8％NaCl膳食诱导的小鼠高血压和肾脏损伤。
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