摘要
目的后囊膜混浊（posteriorcapsularopacification，PCO）是晶状体组织创伤愈合和纤维化的过程，最终导致视力下降。其病理机制为白内障术后或晶状体外伤后残留的晶状体上皮细胞(lensepithelialcells，LECs)在转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）的诱导刺激下，发生增殖、迁移和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）等行为，转化形成的肌成纤维细胞是参与纤维化反应的关键细胞类型，其诱导细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的沉积和重塑是PCO发生中的重要机制，同时大量表达细胞骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleaction，α-SMA）。Wnt5a蛋白是非经典Wnt蛋白家族中的成员之一，作为众多纤维化过程中的关键调节因子，可调节肌成纤维细胞的增殖和转分化，也可在某些纤维化疾病中调控ECM的产生与重塑。本研究旨在探索LECs在TGF-β刺激下，诱导细胞过表达Wnt5a蛋白，后者通过活化非经典Wnt信号通路对人LECs系SRA01/04细胞中EMT发生、ECM重塑以及细胞形态改变的影响及其潜在机制，力求为PCO提供有效的临床防治措施。 方法将研究对象人LECs系SRA01/04细胞分为四组：TGF-β组、Wnt5asiRNA+TGF-β组、Wnt5a组和对照组。用TGF-β诱导SRA01/04细胞过表达Wnt5a蛋白，构建PCO的细胞模型作为TGF-β组；转染Wnt5asiRNA24h后用TGF-β诱导细胞作为Wnt5asiRNA+TGF-β组；在SRA01/04细胞中加入外源性Wnt5a蛋白作为Wnt5a组；对照组为未经处理的SRA01/04细胞。采用Westernblot法检测Wnt5a蛋白、细胞骨架蛋白α-SMA以及ECM主要成分I型胶原（collagenI，Col-I）和纤维连接蛋白（fibronectin，Fn）在蛋白质水平上的表达情况。采用免疫荧光法来检测细胞骨架蛋白α-SMA在人LECs系SRA01/04细胞内的表达和分布情况，以及细胞形态的改变情况。采用细胞划痕实验来评估人LECs系SRA01/04细胞过表达Wnt5a蛋白后，细胞的迁移运动能力的改变情况。采用Col-I凝胶收缩实验来评估人LECs系SRA01/04细胞过表达Wnt5a蛋白后，ECM及细胞的收缩情况。 结果Westernblot法检测人LECs系SRA01/04细胞可见，TGF-β组中各个Wnt蛋白的相对表达量较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.001）；TGF-β组中Wnt5a蛋白的相对表达量较对照组也显著升高，其在24h和48h的相对表达量具有时间依赖性，差异有统计学意义（t=-42.338，P=0.001）。Westernblot法显示，在TGF-β组的SRA01/04细胞中，α-SMA、Col-I和fibronectin的相对表达量均明显高于其余三组，差异有统计学意义（F=11161.395、2507.39、1971.676，均P＜0.001）。免疫荧光法检测显示，TGF-β组SRA01/04细胞中α-SMA的阳性染色程度较其余三组明显增强，且细胞形态发生显著改变。细胞划痕实验发现，TGF-β组SRA01/04细胞48h后的迁移距离显著高于其余三组，且TGF-β组细胞48h内的迁移距离随着时间的延长逐渐增加,差异均有统计学意义（均P＜0.001）。Col-I凝胶收缩实验显示，TGF-β组SRA01/04细胞48h后的凝胶收缩面积比率明显低于其余三组，且TGF-β组细胞48h内的胶原收缩面积比率随着时间的延长逐渐减小，差异均有统计学意义（均P＜0.001）。 结论通过细胞实验证明，LECs在TGF-β诱导下过表达Wnt5a蛋白，通过激活非经典Wnt信号通路促进细胞骨架蛋白α-SMA、ECM主要成分Col-I和fibronectin等的表达，诱导细胞形态改变以及ECM收缩，同时使细胞获得更强的迁移运动和收缩能力。综上，Wnt5a可能是PCO等纤维化疾病新的防治靶点。
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