摘要
谷胱甘肽（GSH）在肿瘤微环境（TME）中过度表达，对GSH含量进行检测可以作为癌症早期诊断的依据，除了可以作为肿瘤检测的标志物之外，利用TME中过度表达的GSH设计GSH响应性纳米药物递送系统（NDDS），与其他无机纳米材料联合应用，通过多模式协同作用可进行癌症特异性治疗。 本论文利用中空二氧化锰（hMnO2）的荧光淬灭能力及GSH响应能力，合成hMnO2-FITC复合材料，构建了简单快速的GSH检测生物传感器，对癌细胞和正常细胞内GSH含量进行检测，评价其水平差异，利用异硫氰酸荧光素（FITC）的荧光特性，进行癌细胞内成像；以此为根据，设计了一种具有GSH响应能力，基于二氧化锰包覆中空介孔有机硅（HMON@MnO2）的靶向癌细胞可程序性释药的双载药纳米平台，通过化疗-光动力学疗法（PDT）-化学动力学疗法（CDT）三模式协同作用进行癌症特异性治疗。 第一部分基于hMnO2-FITC的细胞内GSH含量检测及成像的研究 目的：合成hMnO2-FITC复合材料，构建简单快速的GSH检测生物传感器，对癌细胞和正常细胞内GSH进行检测，评价其水平差异，同时利用FITC的荧光特性，可进行癌细胞内成像，为癌症的早期诊断以及利用TME中过量GSH设计GSH响应性NDDS提供依据。 方法：以MnSO4、NaHCO3和KMnO4为原料，通过盐酸刻蚀掉碳酸锰（MnCO3）内核合成hMnO2。首先，利用透射电子显微镜（TEM）、红外光谱（FT-IR）、X-ray粉末衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）、Zeta电位、紫外分光光度计（UV-vis）和荧光分光光度计对hMnO2进行结构表征。其次，设置激发波长：488nm；发射波长：519nm，对不同浓度FITC以及加入40μg·mL-1hMnO2后不同浓度FITC进行荧光扫描。接下来，通过实验对GSH与hMnO2之间的响应性进行探究，以GSH浓度（C）对519nm处的荧光值（F）进行线性回归，测定GSH线性范围及检测限。通过进行GSH选择性和抗干扰实验来排除细胞内盐类和蛋白质等其它物质的干扰。用细胞破碎仪处理人脑胶质瘤细胞U373、小鼠乳腺癌细胞4T1和人正常肝细胞LO2得到细胞裂解液，用该传感器对不同细胞裂解液中的GSH含量进行检测。最后，采用4T1细胞作为模型，以标准加入法进行回收率试验，评测该方法对复杂的生物样品分析的可行性。采用荧光显微镜对癌细胞内荧光成像进行观测。 结果：TEM结果表明hMnO2分散均匀，呈球形，直径500nm左右，有较大的空腔。FT-IR、XRD、XPS和Zeta电位结果均表明hMnO2的成功合成。hMnO2对FITC荧光的最佳猝灭条件是：40μg·mL-1hMnO2+20ng·mL-1FITC。在最优条件下，该荧光生物传感器的线性范围为10～500μM，检测限为1.76μM。选择性和抗干扰检测结果表明，细胞内蛋白质及盐类等其它物质对该生物传感器的影响很小，可以忽略。通过检测癌细胞和正常细胞的细胞裂解液中GSH含量，并进行比较，结果表明：癌细胞中GSH含量远高于正常细胞。 结论：基于hMnO2的荧光淬灭能力及GSH响应能力设计的荧光法检测GSH的生物传感器具有简便、快速、选择性好等优点，并且具有较低的检测限。应用简单的荧光法验证了癌细胞中的GSH含量高于正常细胞，具有较低的检测限和良好的线性范围，并进行癌细胞内成像，为癌症早期诊断，设计GSH响应性的特异性癌症治疗开拓了新思路。 第二部分：程序性释药的功能化载药纳米平台构建及体外性能的研究 目的：利用二硫键（S-S）和二氧化锰（MnO2）对GSH的响应性，以及MnO2的产氧能力，同时降解得到锰离子（Mn2+）的类芬顿效应，构建基于HMON@MnO2的双载药纳米平台，同时负载化疗药物喜树碱（CPT）和光敏剂二氢卟吩e6（Ce6），实现程序性释放负载药物。 方法：采用“一锅法”合成了中空介孔有机硅（HMON），对其进行氨基化修饰，负载化疗药物CPT，通过柠檬酸原位还原高锰酸钾的方式在其表面包覆一层MnO2，利用聚乙烯亚胺（PEI）进行改性，通过静电吸附在其表面吸附光敏剂Ce6，最后用具有癌细胞靶向能力的叶酸（FA）进行修饰，得到最终的双载药纳米平台HMON-CPT@MnO2-Ce6-FA。应用TEM、FT-IR、UV-vis、XRD、XPS、Zeta电位、氮气吸脱附（BET）、高效液相色谱（HPLC）等手段对纳米平台的构建进行表征。CPT和Ce6的载药量通过UV-vis方法进行计算，其体外释放分别通过HPLC和UV-vis的方法进行计算和追踪。通过UV-vis测定HMON@MnO2的GSH响应能力。通过溶氧仪测定HMON@MnO2-FA的产氧能力。利用亚甲基蓝（MB）检测HMON@MnO2-FA的产羟基自由基（·OH）能力，利用1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）检测HMON@MnO2-Ce6-FA产单线态氧（1O2）的能力。 结果：HMON为粒径50～70nm的球形纳米颗粒，HMON-NH2的BET表面积为515.257m2·g-1，孔体积为1.104cm3·g-1，孔径主要分布在3.8nm，呈现介孔模式，包覆MnO2层后，表面有一些褶皱的凸起。XRD、FT-IR、Zeta电位、UV-vis和XPS均表明HMON@MnO2的成功合成。紫外结果显示HMON@MnO2具有良好的GSH响应能力。UV-vis测定CPT和Ce6的载药量分别为30.99μg·mg-1和22.20μg·mg-1，在pH=5和10mMGSH的作用下CPT在12h内释药率达到40%，Ce6在30min内释药率为70%。溶氧仪测得HMON@MnO2-FA在体外具有良好的产氧能力。MB测得HMON@MnO2-FA在体外具有良好的产·OH能力。DPBF测得HMON@MnO2-Ce6-FA在体外具有良好的产1O2能力。 结论：成功构建的双载药纳米平台HMON-CPT@MnO2-Ce6-FA，在体外能够快速释放光敏剂Ce6，缓慢释放化疗药物CPT，实现程序性释药。在体外，双载药纳米平台具有良好的GSH响应能力且具有良好的体外产氧，产·OH和1O2的能力，在体外具有良好的化学动力学和光动力学性能，为其进一步应用于生物体奠定了基础。 第三部分：程序性释药的功能化载药纳米平台抗肿瘤活性的研究 目的：基于双载药纳米平台HMON-CPT@MnO2-Ce6-FA的良好的体外程序性释药结果及良好的产氧、产·OH和1O2的能力，继续探究其细胞水平及生物体内的抗肿瘤活性。 方法：分别采用人脐静脉上皮细胞（HUVEC）和小鼠乳腺癌（4T1）细胞进行细胞毒性、细胞摄取及细胞内活性氧（ROS）成像及产氧等研究。采用荧光显微镜对细胞内荧光成像进行观测。采用BALB/c小鼠对HMON@MnO2-FA纳米平台的生物安全性进行评价，采用荷瘤BALB/c小鼠对双载药纳米平台HMON-CPT@MnO2-Ce6-FA的肿瘤抑制效果进行评价，采用苏木精-伊红染色法（Hamp;E染色）对组织形态进行观察。 结果：HMON@MnO2-FA纳米平台在细胞水平及小鼠体内均具有良好的生物相容性。4T1细胞对HMON@MnO2-FA纳米平台的摄取能力强于HUVEC细胞。HMON@MnO2-FA纳米平台的MnO2层具有良好的产氧能力。乏氧条件下，在近红外光照射下HMON@MnO2-Ce6-FA和HMON-CPT@MnO2-Ce6-FA处理4T1细胞后，产生的绿色荧光强度与常氧条件下相当。双载药纳米平台HMON-CPT@MnO2-Ce6-FA对于4T1细胞的杀伤作用及对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用明显强于其他实验组。 结论：HMON@MnO2-FA纳米平台具有良好的生物相容性，双载药纳米平台HMON-CPT@MnO2-Ce6-FA在体外具有良好的癌细胞靶向性及4T1细胞的杀伤作用，在体内对荷瘤小鼠的肿瘤具有较好的肿瘤抑制作用，证明化疗-CDT-PDT三模式协同作用相比于单一的癌症治疗手段具有最佳的肿瘤抑制作用。
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