摘要
柑橘中大量积累的类黄酮是一类具有显著药理功能的生物活性物质，其多样的结构是发挥多重生物活性的重要基础。羟基化是丰富类黄酮结构的重要修饰反应，然而柑橘中催化该反应的类黄酮羟化酶（FH,flavonoidhydroxylase）尚未得到鉴定。本文以富含类黄酮的瓯柑（Citrusreticulatacv.Suavissima）为试验材料，开展了柑橘类黄酮羟基合成相关基因FH的鉴别与功能研究。主要研究结果如下： 1.结合柑橘克里曼丁基因组和转录组，对细胞色素P450依赖的单加氧酶超基因家族（CYP450s）成员的系统进化、基因结构、蛋白结构和基因表达模式进行了分析。共鉴别到334个CYP450s成员，分为A组（239个）和non-A组（95个）两个家族，二者的基因结构、蛋白保守结构域和结构模体差异明显。不同CYP450s成员在瓯柑果实不同发育阶段表达丰度和表达模式差异较大。 2.根据转录组测序并结合其他物种FH进行聚类分析，从瓯柑果皮中筛选出30个CYP450s超基因家族成员作为候选FH基因。酵母真核表达酶活分析表明，其中1个候选FH（柑橘基因组登录号：Ciclev10019637m）可以催化柚皮素（黄烷酮类）和芹菜素（黄酮类）底物在3''位点发生羟基化，分别生成圣草酚和木樨草素，具有类黄酮3''羟化酶（F3''H,flavonoid3''-hydroxylase）的功能，因此将其命名为CitF3''H。 3.利用酵母真核表达和柑橘同源基因沉默体系，进一步开展了CitF3''H的功能研究。酵母真核表达酶活分析表明，CitF3''H特异性催化B环4''位点具有羟基的类黄酮底物，包括黄烷酮类、黄酮类、黄酮醇类和二氢黄酮醇类，且对黄烷酮类化合物催化效率最高。随着瓯柑果实成熟，果皮中CitF3''H的表达水平呈现先降低后升高的趋势，可能与CitF3''H同时参与黄烷酮支路和多甲氧基黄酮支路中的3''位点羟基化有关。CitF3''H基因沉默的椪柑株系中，3''位有取代基团的类黄酮含量平均下降60%。以上结果共同验证了CYP450s超基因家族成员CitF3''H（CYP75B1）具有调控类黄酮3''位羟基化的生物学功能。
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