摘要
研究背景 造血干细胞移植（hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT）是目前治愈血液恶性疾病的重要手段之一，但移植物抗宿主病（graftversushostdisease，GVHD）的发生严重影响着患者的生存和生活质量。慢性GVHD（chronicGVHD，cGVHD）发生率高达30%-70%，其中皮肤是最常见的靶器官。但由于发病机制复杂且缺少针对性治疗方法，在临床上很难达到理想的治疗效果，亟待从机制上进行深入研究。在基础研究中，常通过构建cGVHD小鼠模型开展研究，但针对不同的研究目的选择合适的小鼠模型至关重要。目前所构建的cGVHD小鼠模型常伴有急性移植物抗宿主病（acuteGVHD，aGVHD）过程，cGVHD的多个靶器官也会不同程度累及，对单一器官损伤的研究带来干扰，影响研究结果的准确性。 目的 本研究致力于构建皮肤优势型cGVHD小鼠模型且以皮肤损伤为主要表现，并探索本模型基本特征和分析T细胞亚群特点。 方法 在构建cGVHD小鼠模型时，以致死剂量辐照方式模拟清髓预处理。仅移植供体小鼠骨髓细胞，模拟造血干细胞移植的过程（BM组）；而同时移植供体小鼠脾脏细胞，模拟cGVHD的发生（cGVHD组）。由于供体和宿主小鼠主要组织相容性复合体（majorhistocompatibilitycomplex，MHC）相同，但次要组织相容性抗原（minorhistocompatibilityantigens，miHAs）不同，所以构建的cGVHD小鼠模型通常起病缓慢并且类似于人cGVHD的发病特点。在本研究中，以B10.D2小鼠为供体，BALB/c小鼠为宿主构建皮肤优势型cGVHD小鼠模型。通过观察小鼠皮肤表现和胸腺功能，评估是否发生cGVHD；通过对生存、弓背及体质量等表现评分，评估模型cGVHD的基本特征；通过对组织切片的观察，在组织层面判断cGVHD过程对皮肤、肝脏、肺脏和肠道的影响。在构建模型后，提取靶器官细胞进行流式检测，分析在本模型中皮肤、肝脏和肺脏T细胞亚群的基本情况。为避免单一模型的局限性，在实验中还构建其它cGVHD小鼠模型，以验证所得结论的真实性。由于小鼠和人之间物种的差异，在实验中同时构建了人源化GVHD小鼠模型进行对比。 结果 本研究以B10.D2小鼠为供体，以7.5Gy致死剂量辐照的BALB/c小鼠为宿主，通过移植供体来源的骨髓细胞（10×106/只）和脾脏细胞（18×106/只），成功构建皮肤优势型cGVHD小鼠模型。BM组小鼠在移植后能够逐渐恢复正常，因此可以排除实验因素对cGVHD组小鼠的影响。cGVHD组小鼠以皮肤病变为主，主要包括脱毛、皮屑、瘢痕以及皮肤皱缩，在移植后20天开始出现并随时间逐渐加重。在cGVHD组的胸腺中，CD4+CD8+T细胞比率和绝对数显著下降，反映出胸腺功能受损。相对BM组小鼠的正常状态，cGVHD组小鼠生存率及体质量逐渐下降，弓背和体质量评分同步升高。但两组之间腹泻评分没有显著差异，提示未出现肠道cGVHD表现。观察皮肤、肝脏、肺脏和结肠的组织切片，仅cGVHD组小鼠皮肤明显出现纤维化及胶原沉积，病理评分显著升高。所以本模型仅以皮肤为主要靶器官，并且呈现典型cGVHD表现。 对各器官T细胞亚群进行分析，发现Th1细胞、CD4+IL-13+T细胞和Tc1细胞显著增加，与cGVHD发病关系密切。深入分析后发现了一群新的CD4+T细胞亚群，其特点是存在IFN-γ和IL-13共表达，即CD4+IFN-γ+IL-13+T细胞。对该模型CD4+T细胞做单细胞转录组的拟时分析，发现BM组细胞趋近于正常状态，而cGVHD组则向不同方向增殖分化。同时还发现CD4+IFN-γ+IL-13+T细胞在cGVHD中存在两种分化方向。我们推测，CD4+IFN-γ+IL-13+T细胞具有异质性，仅在cGVHD组中存在的细胞亚群才可能与疾病的发生相关。在敲除供体小鼠IL-13之后，CD4+T细胞中IL-4表达显著升高并与IFN-γ共表达。同时我们构建了人源化GVHD小鼠模型，发现IFN-γ与IL-4共表达，而不是与IL-13，体现了小鼠与人之间的差异性。 结论 本研究成功构建了皮肤优势型cGVHD小鼠模型，以皮肤cGVHD为主要表现。T细胞亚群分析发现：Th1细胞、CD4+IL-13+T细胞和Tc1细胞与cGVHD发病密切相关，并发现CD4+IFN-γ+IL-13+T细胞新亚群，其功能有待进一步确认。在人源化的GVHD小鼠模型中，发现为CD4+IFN-γ+IL-4+T细胞存在，体现出小鼠与人的差异性。
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