摘要
农药作为防治病虫草鼠害的化学药剂，在农业领域发挥着不可或缺的作用。但农药的过度使用，导致生态富集、环境遭到破坏，甚至频频发生由于农药残留而引起的食品中毒事件，已经严重威胁到人类的生命安全。然而，解决上述问题不仅要在前期农药的使用方法上有所讲究和控制，同时后期农副产品的农药残留检出也是十分关键的。目前，农药残留检测方法普遍存在仪器昂贵、前处理复杂检测时间过长以及需要专业技术人员操作等问题，由此可见，快速灵敏且操作简单的新型农药残留检测方法的构建对于国计民生来讲是十分重要的。开发廉价易得、操作简单且灵敏度高的新方法用于农副产品中农药残留的检测，也是科研人员持续关注和努力研发的方向。 农药残留快速检测中酶抑制法由于其较好的响应一直受到科研人员的青睐，特别是羧酸酯酶(CES)，由于其在农残检测中较高的使用率和匹配度更是脱颖而出。由此，本次研究选择基于CES抑制法，设计合成一系列可对CES响应的近红外有机荧光探针，用于间接检测农药残留及生物成像，旨在对日后农药残留检测新技术的发展提供一定的理论支持。 综上，本课题分别从以下几个方面展开了研究工作: (1)基于CES在催化荧光探针时，酯基部分自发水解暴露出荧光探针，完成turnoff到turnon的荧光响应变化原理。本研究中，通过引入磺酸根提高水溶性，经过四步反应合成半花菁骨架的荧光染料Cy-OH;其次设计合成六种可以识别并响应的侧链基团，通过酰基化连接在Cy-OH上，用以研究不同特性侧链基团对CES响应性质的影响;然后对六种荧光探针的紫外及荧光光谱性质展开对比研究，筛选出与CES响应最好的荧光探针(探针1:在0-10mU/mL的范围内，与CES呈现良好的线性关系，线性方程为F=205640[C(mU/mL)]+411083，R2=0.9910，且检测限达到0.0562mU/mL)。本论文研究选用探针1展开后续性质研究及其在有机磷农药残留检测和生物成像中的应用研究。 (2)针对该荧光探针的性质展开多方面的探究工作。首先，研究了荧光探针l对pH的稳定性实验及温度响应实验，结果表明荧光探针1可以在生理pH和生理温度下对CES进行检测;其次，通过实时响应实验及酶代动力学实验，研究了荧光探针1对CES的响应速度与能力，结果显示探针1对CES的响应能力较为良好，且响应速度快;最后，通过高效液相色谱法及质谱法对荧光探针l响应CES的机理进行了验证。 (3)确认荧光探针1的体外性质及其检测CES的可行性后，本研究围绕这一响应机理积极展开了相关的检测应用研究。首先，基于酶抑制法对有机磷农药残留进行了检测，有机磷农药抑制CES的活性，导致CES无法与荧光探针l进行响应，继而引起荧光强度响应变化。实验表明，探针1荧光强度与水胺硫磷浓度在0-10μg/L范围内存在良好的线性关系，其线性方程为:F=-106932n+2472776，R2=0.9961，检测下限为0.1734μg/L，低于国家标准最大残留量0.5mg/kg。随后，通过食品样品中的加标回收率进一步确认，探针1可以用来检测实际食品样品中的有机磷农药残留。其次，本研究通过细胞毒性实验验证，荧光探针1对细胞具有低毒性，并且展开了Hela细胞内源性CES的成像研究和金黄色葡萄球菌与大肠杆菌中的成像研究，确认该荧光探针1具有良好的细胞及细菌成像特性，这为后续农药残留的荧光成像实时监测研究做好铺垫，提供了可能性。
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