摘要
目的 甲状腺乳头状癌（Papillarythyroidcarcinoma，PTC）是甲状腺癌最常见的一种病理类型，预后较好。但是PTC术后的患者仍面临许多复发的高危因素，因此，探寻PTC术后早期复发的生物标志物对临床医生和患者都具有极其重要的意义。肿瘤突变负荷（Tumormutationburden，TMB）是指肿瘤基因组每个编码区域体细胞非同义突变的总数。TMB的检测主要基于大规模的下一代测序或全外显子组测序，现已成为评估免疫检查点抑制剂的有效性和癌症预后的生物标志物。但是TMB在PTC中的作用及其对PTC免疫微环境的影响尚不清楚。我们的研究旨在探讨TMB与PTC临床特征的关系，确定其对PTC免疫微环境的影响和TMB相关基因在PTC的预后作用。 方法 从癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）数据库下载PTCRNA测序和基因组测序的数据，共纳入512例肿瘤样本和58例正常的样本。使用“maftools”软件包将VariantCallFormat格式的突变数据转换为可视化结果。计算每个样本的TMB值，并通过中位值将PTC样本分为高TMB和低TMB组。使用Kaplan-Meier分析比较高TMB组和低TMB组无复发生存率（recurrence-freesurvival，RFS）的差异，通过Wilcoxon秩和检验比较两组TMB与临床变量之间的差异。利用“EdgeR”包筛选PTC患者高TMB和低TMB组的差异基因（differentiallyexpressedgenes，DEGs），表达倍数gt;1，且错误发现率（FalseDiscoveryRate，FDR）＜0.05。利用“pheatmap”程序包绘制DEGs的热图，并通过“Vioplot”程序包绘制差异基因的火山图。随后，将差异基因进行GeneOntology（GO）分析，及通过基因富集软件（GSEA4.0.1）进行KEGG信号通路分析。通过CIBERSORT网站的反卷积算法，计算出高TMB和低TMB两组样本的22种肿瘤浸润性免疫细胞丰度，并用“Vioplot”包展示两组之间的免疫细胞差异。利用生存曲线R包将这些差异基因表达量同PTC患者的RFS进行整合分析，绘制生存曲线。本研究还通过RT-PCR、免疫组化、westernblot和Elisa等实验技术检测了目的差异基因在PTC样本癌与癌旁中的表达情况，进一步探究该差异基因在PTC发生、发展中的作用及机制。 结果 PTC样本TMB的范围为0.026至2.210Mut/Mb，中位数为0.211Mut/Mb。PTC最常见的突变类型是错义突变，单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphisms，SNP）的发生率比插入或缺失更高，单个核苷酸变异（Singlenucleotidevariant，SNV）以C＞T碱基取代为主，每个样本的突变中位数为6。突变频率排名前五的基因分别为BRAF（59％）、NRAS（8％）、HRAS（3％）、TG（3％）和TTN（2％）。无复发生存分析结果提示，高TMB组预后较低TMB组差。此外，年龄＞55岁及男性组的TMB水平较高；AJCC分期中T3-4组比T1-2组的患者具有更高的TMB水平；StageⅢ-Ⅳ期的TMB水平明显高于StageI-Ⅱ期。但是，AJCC-N、M、三种病理亚型和BRAF突变与否分组的TMB水平均没有显著性差异（P＞0.05）。ROC曲线分析结果提示，TMB的AUC值为0.780，高于年龄（AUC=0.658），性别（AUC=0.421），AJCC-T（AUC=0.668），N（AUC=0.566），M（AUC=0.611），肿瘤分期（AUC=0.708）或BRAF状态（AUC=0.520）。从高、低TMB组中鉴定出18个DEGs，GO富集分析发现这些基因富集的生物学功能主要体现在动物器官再生，细胞外基质，粗糙内质网，受体拮抗剂活性，受体抑制剂活性和类固醇激素受体活性。GSEA结果提示高TMB组的肿瘤比低TMB组的氧化磷酸化（OXPHOS）水平更高。在18个差异基因中，有4个基因与无复发生存率相关，分别是白介素37（Interleukin37，IL-37），溶质载体家族成员5（solutecarrierfamily5member，SLC5A5），核受体亚家族4A组成员3（nuclearreceptorsubfamily4groupAmember3，NR4A3）和精子尾部的外部致密纤维1（ODF3L1）。IL-37在肿瘤中的表达水平显著高于正常组织，且在预后不良的临床特征组中高表达，而SLC5A5，NR4A3和ODF3L1则在正常组织中的表达显著高于肿瘤组织，且在预后较好的临床特征组中高表达。与低TMB组的PTC样本相比，高TMB组的PTC样本有着较低的CD8+T细胞和M1巨噬细胞的浸润，但有着较高的γ-δT细胞浸润。我们后续的实验结果表明IL-37在PTC肿瘤中的表达显著高于对应的正常组织。 结论 基于TCGA数据库，本研究结果表明TMB是预测PTC复发的独立预后因素，并阐释了其可能的机制。高、低TMB组的差异基因IL-37、SLC5A5、NR4A3和ODF3L1与PTC患者无复发生存率显著相关。其中，数据库和实验结果均表明IL-37可能在PTC的进展中发挥着重要作用，在指导PTC患者的术后随访和预测复发方面值得探索。
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