摘要
目的： 本研究旨在探索雌激素相关受体α（Estrogen-relatedreceptorα，ERRα）在乳腺癌中的表达模式和生物学功能；在此基础上进一步研究ERRα在乳腺癌顺铂耐药中的作用并探讨其耐药机制。 方法： 1.利用癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas,TCGA）在线数据库和乳腺癌病人组织免疫组化分析ERRα在乳腺癌组织中的mRNA和蛋白水平，以阐明其表达模式和临床病理特征的关系。 2.在乳腺癌细胞中进行功能获得/功能缺失实验，通过克隆形成、CCK8、Transwell和检测上皮-间充质转化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）标志物蛋白水平以评估ERRα对乳腺癌细胞体外增殖和转移能力及EMT的影响。 3.通过检测并比较5种乳腺癌细胞中ERRα表达水平和IC50值，利用不同浓度的顺铂和不同时长刺激乳腺癌细胞观察ERRα表达水平变化以探究ERRα与顺铂的联系。 4.在乳腺癌细胞中进行过表达/敲低，通过IC50和干细胞成球实验以评估ERRα在乳腺癌顺铂耐药中的作用。 5.分别采用qPCR和Westernblot检测乳腺癌亲本细胞株MCF-7和乳腺癌MCF-7顺铂耐药株（MCF7/DDP）中ERRα的表达水平。 6.构建shERRα质粒并转染MCF7/DDP细胞，检测敲低ERRα对MCF7/DDP细胞的生物学功能的影响。在顺铂处理条件下，利用IC50、干细胞成球实验、干细胞相关分子标志物mRNA表达水平检测、克隆形成、CCK8、划痕、Transwell、流式细胞周期和周期相关蛋白检测实验观察敲低ERRα后MCF7/DDP对顺铂的抵抗能力。 7.联合转录组测序和CUTamp;Tag（Cleavageundertargetsamp;tagmentation）寻找ERRα潜在的下游靶基因，筛选出13个候选基因并利用qPCR在3种乳腺癌细胞中进行表达量的验证。通过双荧光素酶报告基因实验确定ERRα能否调控目的靶基因，并寻找他们的结合位点。 8.在ERRα低表达的耐药株中进行细胞周期蛋白E2基因（CyclinE2，CCNE2）过表达rescue实验以阐明ERRα介导乳腺癌细胞顺铂耐药机制。 结果： 1.UALCAN和TheHumanProteinAtlas数据库分析表明，与正常组织相比，ERRα在乳腺癌组织中高表达且与预后较差相关（P＜0.05）；免疫组化发现，ERRα在乳腺癌组织中阳性面积比率、平均光密度和面密度均显著高于癌旁组织（P＜0.05）；在63对癌旁和乳腺癌组织中配对t检验发现ERRα在乳腺癌组织中显著上调（P＜0.05）；ERRα表达水平与患者人表皮生长因子受体-2（humanepithelialgrowthfactorreceptor-2,HER2）表达水平显著相关（P＜0.05），ERRα高表达的患者HER2阳性比例明显升高。 2.与正常乳腺细胞MCF-10A相比，乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7、SKBR-3、UACC-812和BT-474中ERRαmRNA水平显著升高；克隆形成、CCK8和Transwell实验发现过表达ERRα能促进乳腺癌细胞增殖和转移，而敲低ERRα抑制了促癌作用（P＜0.05）；过表达ERRα增强间充质标志物β-Catenin、Vimentin和Slug蛋白的表达，并下调上皮标志物上皮型钙黏附蛋白（E-cadherin）和带状闭合蛋白1（Tightjunctionproteinzonulaoccludens-1，ZO-1）蛋白的表达，敲低ERRα后EMT相关蛋白也随之变化。 3.相关性分析发现5种乳腺癌细胞IC50值与ERRαmRNA表达水平呈正相关（P＜0.05）；顺铂刺激MDA-MB-231细胞0h、12h、24h、36h和48h后，ERRα逐渐被诱导；用0μM、1μM、2μM、4μM和8μM的顺铂作用于MDA-MB-231细胞时，顺铂诱导的ERRα的表达明显以剂量依赖性方式表现出来。 4.IC50实验发现过表达ERRα后乳腺癌细胞生长抑制率IC50值明显升高，而敲低ERRα后生长抑制率IC50值下降（P＜0.05）；ERRα能够促进肿瘤球的形成（P＜0.05）。 5.与亲代乳腺癌细胞MCF-7相比，ERRα在顺铂耐药的MCF7/DDP细胞中表达水平明显升高（P＜0.05）。 6.在顺铂处理条件下，利用IC50、干细胞成球实验、干细胞相关分子标志物mRNA表达水平检测、克隆形成、CCK8、划痕、Transwell、流式细胞周期和周期相关蛋白检测实验发现敲低ERRα后MCF7/DDP对顺铂的抵抗能力明显减弱（P＜0.05）。 7.对筛选出的13个差异倍数较大并且有报道与肿瘤化疗耐药相关的基因进行qPCR验证，结果显示CCNE2、RAD51重组酶（RAD51recombinase,RAD51）和X线修复交错互补基因1（X-rayrepaircrosscomplementinggene1，XRCC1）在3种乳腺癌细胞中表达水平趋势一致（P＜0.05），并且出现了一定程度上的顺铂刺激诱导表达的现象。在低表达ERRα的BT-474-shERRα和MCF7/DDP-shERRα细胞中过表达CCNE2、RAD51和XRCC1后，发现与对照组相比，过表达组细胞IC50值都明显上升（P＜0.05）；双荧光素酶报告基因实验证实，ERRα能够直接靶向并调控CCNE2的表达（P＜0.05），且结合位点位于?2000至?1691bp之间。 8.IC50、干细胞成球、干细胞相关分子标志物mRNA表达水平检测、克隆形成、CCK8、划痕、Transwell和、流式细胞周期实验证明过表达CCNE2能够逆转敲低ERRα导致的MCF7/DDP对顺铂的敏感性（P＜0.05）。 结论： ERRα在乳腺癌细胞中的高表达能够促进乳腺癌细胞增殖和转移；ERRα通过靶向调控CCNE2的表达，增加乳腺癌细胞干性程度，从而促进乳腺癌细胞顺铂耐药。
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