摘要
目的： 芍药苷是一种单萜苦味甙，是从芍药根中分离得到的一种活性成分，本课题研究了芍药苷作为潜在的流感病毒抑制剂，在体内外对由甲型H1N1流感病毒诱发的急性肺损伤的保护作用及潜在机制研究。 方法： 实验一：芍药苷体外抗H1N1流感病毒作用研究 1.用MTT法计算芍药苷在MDCK细胞上的药物毒性以及确定无毒有效浓度。 2.运用观察细胞病变（CPE）法结合MTT法检测不同浓度下芍药苷对感染甲型流感病毒的MDCK细胞病变的抑制作用，根据实验结果计算出半数有效剂量EC50以及治疗指数TI。 3.使用神经氨酸酶活性测试试剂盒检测芍药苷对H1N1流感病毒对感染后的MDCK中神经氨酸酶活性的影响。 4.采用Real-timePCR技术检测不同浓度下芍药苷对感染H1N1流感病毒的MDCK细胞病毒载量的影响。 实验二：芍药苷体内抗H1N1流感病毒作用研究 1.芍药苷对于流感H1N1病毒感染小鼠的死亡保护作用 2.计算在甲型H1N1流感病毒感染下的小鼠，在不同浓度的芍药苷药物的作用下的肺指数，评价不同浓度下芍药苷对感染甲型流感病毒小鼠的治疗作用。 3.将被不同浓度芍药苷药物作用下的小鼠肺进行HE染色，观察其病理变化，评价在不同浓度下芍药苷对被感染病毒的小鼠肺的病理影响。 4.将被不同浓度芍药苷药物作用下的小鼠肺进行MTS染色，通过观察肺部纤维化的变化，从而评估不同浓度下芍药苷对被感染病毒的小鼠肺的胶原蛋白的影响。 实验三：芍药苷对H1N1流感病毒诱导的急性肺损伤小鼠机制研究 1.不同浓度下芍药苷对甲型流感病毒H1N1诱导小鼠肺组织的细胞因子水平的影响。 2.不同浓度下芍药苷对甲型流感病毒H1N1感染小鼠肺组织纤维化标志物水平的影响。 3.不同浓度下芍药苷对流感病毒诱导的小鼠肺Ⅰ型、Ⅲ型胶原（collagen）mRNA水平影响 4.不同浓度下芍药苷对甲型流感病毒H1N1感染的小鼠肺中αvβ3、TGF-β1、NF-κB、p38MAPK和p-smad2蛋白表达的影响。 结果： 一、芍药苷在体外实验MDCK细胞上的抗甲型H1N1流感病毒作用研究 1.用MTT法测得芍药苷对MDCK细胞的药物半数有毒浓度（TC50）为4160μM，阳性药物的TC50为2888μM。 2.研究了芍药苷在130.125-2082μM浓度之间可显著减少感染流感病毒的模型组的细胞病变。芍药苷(260-1040μM)可提高受感染细胞的存活率，且呈剂量依赖性。 3.其中芍药苷组在520μM、1040μM浓度对于抑制NA活性的作用与阳性药物组效果相当，甚至芍药苷在1040μM浓度时相对于阳性药物有更甚的效果。 4.与病毒模型组(1.21±0.26)相比，阳性药物奥司他韦（0.46±0.10）组中的流感病毒M基因mRNA水平明显下降，芍药苷在1040μM浓度下的流感病毒M基因mRNA水平也有明显下降（0.53±0.20）。 二、芍药苷在体内实验对甲型流感病毒诱导的小鼠作用研究 1.芍药苷50、100mg/kg组的流感模型小鼠的平均生存天数均高于未给药物治疗的病毒模型（IAV-C）组。阳性药物奥司他韦可保护80%的小鼠免受致命感染，芍药苷50mg/kg组可保护40%的小鼠免受致命感染，芍药苷100mg/kg组可保护50%的小鼠免受致命感染。 2.芍药苷（50和100mg/kg）可减轻小鼠肺部炎症。甲型流感病毒H1N1病毒模型组（IAV-C）组的肺指数为1.58±0.53，而芍药100和50mg/kg组的肺指数分别为1.06±0.40和1.14±0.11，与IAV-C组相比，芍药显著降低了肺指数。 3.芍药苷50和100mg/kg两组的肺组织病毒滴度分别为4971.1.42±1138.98和4135.49±875.10，类似于10mg/kg的阳性药物组Ose（2942.26±1645.66），相较于IAV-C组（8731.05±1419.25）都有显著的降低。 4.在小鼠病理组织研究中，正常小鼠的肺组织没有充血炎症的表现；病毒模型组总体呈现出炎症充血的状态，并且存在严重的肺实变；芍药苷50mg/kg、100mg/kg以及阳性药物奥司他韦组的鼠肺在光镜下都有一定程度的充血和炎症，并有相对于病毒模型组较轻的肺实变。 三、芍药苷在体内实验对甲型流感病毒诱导的急性肺损伤小鼠机制研究 1.在IL-1β、TNF-α，IL-6，IFN-γ细胞因子的表达上芍药苷组（50和100mg/kg）分别显著低于IAV-C组。 2.检测肺纤维化标志物时，芍药苷组(50、100mg/kg)血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C分别为338.30±62.74、408.45±49.05、43.53±5.40、13.11±2.96和431.44±97.15、410.81±29.78、53.87±6.49、15.99±3.67ng/ml，较IAV-C组显著降低(p＜0.01或0.001)。 3.与IAV-C组相比，芍药苷(50和100mg/kg)显著抑制肺组织中胶原ColI和胶原ColⅢ的表达水平。 4.芍药苷通过控制NF-κB、αvβ3、TGF-β1、p-Smad2和p38MAPK蛋白表达信号转导来减少胶原沉积和炎症反应，与IAV-C组相比蛋白水平表达显著降低。 结论： 通过体内外的实验研究，发现芍药苷可抑制流感病毒的复制，并且缓解肺部炎症和纤维化，对甲型流感病毒(IAV)诱导的急性肺损伤ALI有着保护作用，其潜在机制可能与其调控αvβ3/TGF-β1/Smads信号通路有关。为发现甲型流感病毒IAV诱导的急性肺损伤ALI的治疗提供可能的药物。
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