摘要
目的： 慢性脑低灌注（CCH）所致的血管性认知功能障碍，已愈加严重影响老年患者的生活质量，给社会与家庭带来了较大的负担。随着中医药研究的深入，利用中医药防治老年缺血性脑血管病已日益受到重视。本研究通过双侧颈总动脉结扎术建立慢性脑低灌注大鼠模型，对大鼠给予盐酸小檗碱灌胃治疗，并对大鼠的学习与记忆功能、神经元损伤与修复、细胞外调节蛋白激酶（ERK）/核因子-E2相关因子2（Nrf2）信号通路、炎症因子及小胶质细胞的调节、血脑屏障的损伤与改善等方面进行检测，旨在探讨小檗碱对CCH大鼠血管性认知功能障碍的保护作用，为小檗碱治疗缺血性脑血管提供新的研究方向。 方法： 成年雄性SD大鼠75只，随机分为三组：假手术组（Sham，n=25）、慢性脑低灌注组（CCH）和小檗碱组（Berberine，n=25）。采用双侧颈总动脉结扎法（BCCAO，n=25）建立慢性脑低灌注大鼠模型，术后第二天开始给药，小檗碱组大鼠持续灌胃盐酸小檗碱42天。 利用Morris水迷宫检测各组大鼠学习与记忆功能。 采用苏木精-伊红染色法（HE）检测各组大鼠皮层以及海马区病理损伤与修复。采用免疫荧光染色法（Immunofluorescencestaining）检测突触素（Synaptophysin）与神经元细胞核（NeuN）、微管结合蛋白2(MAP2)与NeuN在皮层与海马区的共定位表达，通过免疫印迹法（WesternBlot）检测大鼠脑组织内Synaptophysin的表达，探索各组大鼠皮层与海马区的神经元损伤与修复。 采用WesternBlot检测大鼠脑组织内磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）和Nrf2的表达，探索小檗碱改善CCH损伤机制与ERK/Nrf2通路的相关性。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠脑组织内抗炎因子白细胞介素-4（IL-4）与白细胞介素-10（IL-10）的表达，探索小檗碱对CCH大鼠抗炎因子的影响。通过免疫荧光染色法检测小胶质细胞标记物离子钙结合衔接分子1（Iba1）在皮层、胼胝体以及海马区的表达，通过WesternBlot检测Iba1以及小胶质细胞M1表型标志物CD16、M2表型标志物精氨酸酶-1（Arg1）在皮层以及胼胝体的表达，探索小檗碱改善慢性脑缺血大鼠认知障碍与神经系统炎症的相关性。 通过ELISA检测大鼠血浆中血管内皮生长因子-A（VEGF-A）与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，探索小檗碱改善CCH大鼠认知障碍与血脑屏障的相关性。 结果： 水迷宫检测结果显示，CCH组大鼠逃离潜伏期显著高于Sham组（第三天与第五天P＜0.01，第四天P＜0.001），游泳过程中，航行轨迹混乱无序，撤去平台后，CCH组大鼠穿越平台次数、目标象限停留时间与路程均较Sham组有显著下降（穿台次数P＜0.0001，目标象限时间与路程占比P＜0.05），小檗碱灌胃治疗后，以上现象均有明显改善。 HE染色结果显示，在大鼠脑皮层、海马CA1与CA3区，Sham组神经元排列紧密，形态正常，结构完整，细胞核清晰，未见有明显损伤；CCH组神经元排列松散、结构疏松，皮层神经元固缩变性，海马萎缩；Berberine组可见皮层与海马区神经元结构较紧密，形态较完整，受损神经元有显著改善。 免疫荧光检测Synaptophysin与NeuN、MAP2与NeuN在皮层及海马区的共定位表达，CCH组大鼠Synaptophysin与MAP2荧光强度均较Sham组显著下降（P＜0.001amp;P＜0.0001），小檗碱治疗后，Synaptophysin与MAP2的荧光强度均较CCH组显著升高（P＜0.001amp;P＜0.0001）。WesternBlot结果显示，CCH组Synaptophysin在皮层与海马组织内的表达量较Sham组显著下降（皮层P＜0.001，海马P＜0.05），Berberine组Synaptophysin的表达量较CCH组有显著升高（皮层P＜0.0001，海马P＜0.01）。 WesternBlot检测p-ERK与Nrf2在大鼠脑组织内的表达，结果显示，皮层与胼胝体中，CCH组大鼠p-ERK与Nrf2的表达较Sham组显著下降（皮层P＜0.05，胼胝体P＜0.01）；海马组织中，CCH组大鼠p-ERK与Nrf2的表达较Sham组有所下降，但无显著差异；而Berberine组大鼠p-ERK与Nrf2的表达在皮层、胼胝体、海马组织内均显著高于CCH组（P＜0.05amp;P＜0.001）。ELISA检测结果显示，Berberine组大鼠脑组织内抗炎因子IL-4与IL-10的表达均显著高于CCH组（P＜0.05）。 免疫荧光检测Iba1在各组大鼠脑皮层、胼胝体、海马区的表达，结果显示，在CCH组大鼠中，Iba1阳性细胞数量在海马CA1与CA3区均较Sham组有显著增加（海马CA1区P＜0.001，海马CA3区P＜0.05），而Berberine组Iba1的数量在海马CA1与CA3区则较CCH组有所减少，但无显著差异。WesternBlot检测显示，Berberine组Iba1的表达量在皮层组织内显著高于Sham组（P＜0.001）与CCH组（P＜0.01）。在海马组织中，CCH组Iba1的表达显著高于Sham组（P＜0.01），Berberine组Iba1的表达显著低于CCH组（P＜0.05）。 在胼胝体组织中，小胶质细胞M1表型标志物CD16的表达在CCH组显著高于Sham组（P＜0.01），Berberine组显著低于CCH组（P＜0.05）；在皮层组织中，M2表型标志物Arg1的表达在CCH组显著低于Sham组（P＜0.01），Berberine组显著高于CCH组（P＜0.001）。 血浆ELISA检测结果显示，VEGF-A与MMP-9的表达在CCH组均显著高于Sham组（P＜0.0001），而在Berberine组的表达均显著低于CCH组（P＜0.0001）。 结论： 小檗碱可改善CCH大鼠的血管性认知功能障碍，可能是通过以下机制： 1.小檗碱可通过抑制氧化应激，减少慢性脑低灌注后神经元丢失，促进神经元细胞存活； 2.小檗碱可通过干预ERK/Nrf2信号通路，促进抗炎因子IL-4与IL-10在脑组织内的表达，抑制慢性脑低灌注状态下的炎症反应。 3.小檗碱可通过调节小胶质细胞的表达，并促使其由促炎M1表型向抗炎M2表型极化，减轻慢性脑低灌注所致的炎症反应。 4.小檗碱可通过抑制VEGF-A与MMP-9在血浆中的表达，改善慢性脑低灌注大鼠的血脑屏障损伤。
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