摘要
目的 探究氧化应激在镉诱导小鼠睾丸间质TM3细胞自噬和凋亡中的作用以及自噬对镉诱导TM3细胞凋亡的影响。 方法 CCK-8法检测CdCl2对TM3细胞活性的影响。采用0、5、10μMCdCl2处理TM3细胞，MitoTrackerRedCMXRos染色法观察TM3细胞线粒体形态;JC-1染色定量检测TM3细胞线粒体膜电位;DCFH-DA探针法检测TM3细胞内活性氧水平;mCherry-EGFP-LC3b质粒转染TM3细胞，荧光共聚焦显微镜检测CdCl2对TM3细胞自噬流的影响:Hoechst33342染色法和流式细胞术检测TM3细胞凋亡;Westernblot检测TM3细胞氧化应激相关蛋白HO-1、SOD2，自噬相关蛋白LC3、P62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleavedCaspase-3的表达水平;在含/不含CdCl2(10μM)的细胞培养液中加入氧化应激抑制剂NAC(200μM)处理TM3细胞24h，Westernblot检测细胞氧化应激、自噬和凋亡相关蛋白的表达水平。在含/不含CdCl2(10μM)的细胞培养液中分别加入自噬抑制剂3-MA(150μM)和氯喹(CQ，10nM)处理TM3细胞24h，检测细胞自噬与凋亡水平，分析CdCl2诱导TM3细胞自噬与细胞凋亡的关系。 结果 1、CdCl2可诱导TM3细胞氧化应激、自噬和凋亡 与对照组相比，染毒组TM3细胞线粒体网状结构被破坏，线粒体形态由长管状变为点状，含点状线粒体的细胞比例逐渐升高，线粒体膜电位降低，细胞内活性氧水平升高和凋亡细胞比例升高。CdCl2阻碍自噬体与溶酶体的融合过程。Westernblot结果显示，HO-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62及cleavedCaspase-3的蛋白表达显著增加，而SOD2和Bcl-2蛋白的表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2、CdCl2促进ROS产生引起TM3细胞自噬异常和凋亡 用N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)抑制细胞氧化应激后，与镉染毒组相比较，(NAC+Cd)组中Hoechst33342染色细胞核染色减弱、亮蓝色凋亡小体数量减少，Westernblot结果显示HO-1、LC3-IFLC3-Ⅰ、P62和cleavedCaspase-3蛋白表达量均降低，而SOD2、Bcl-2蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示抑制TM3细胞氧化应激后，CdCl2对细胞自噬和凋亡的诱导作用均明显减弱。 3、CdCl2通过抑制自噬流诱导TM3细胞凋亡 自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和氯喹(CQ)处理细胞后，与Cd染毒组相比较，(3-MA+Cd)组Hoechst33342染色细胞核染色减弱、亮蓝色凋亡小体数量减少，(CQ+Cd)组中细胞核染色加强、亮蓝色凋亡小体数量增多;Westernblot结果显示(3-MA+Cd)组细胞Bcl-2蛋白水平升高而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62和cleavedCaspase-3蛋白水平降低，(Cd+CQ)组细胞中Bcl-2蛋白水平降低而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62和cleavedCaspase-3蛋白水平进一步升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示3-MA通过抑制自噬体形成降低自噬水平从而缓解镉诱导的TM3细胞凋亡;CQ通过抑制自噬体与溶酶体的融合过程从而加剧镉诱导的TM3细胞凋亡。 结论 CdCl2通过激活氧化应激引起小鼠睾丸间质TM3细胞自噬异常和细胞凋亡，其介导的自噬体与溶酶体融合阻滞在细胞凋亡中起细胞毒性作用。
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