摘要
目的: 肺腺癌(LungAdenocarcinoma，LUAD)作为一种死亡率极高的癌症，其有效治疗一直是个挑战。虽然PD-1/PD-L1抑制剂是治疗实体肿瘤的有效药物，但对于一些难治性肿瘤同样束手无策。A2aR拮抗剂是一种腺苷抑制类肿瘤免疫微环境调节药物，因其具有极大治疗实体肿瘤的潜力逐渐进入人们的视野。本文试图探讨A2aR在LUAD的免疫微环境中所发挥的潜在功能和治疗潜力。 方法: 使用网络数据库分析A2aR表达的生存意义。继而通过组织免疫荧光染色观察A2aR的细胞定位。通过Transwell方法检测在有/无A2aR拮抗剂(ZM241385)时巨噬细胞的迁移水平。随后通过RT-qPCR检测在五种不同LUAD细胞上A2aR的表达水平及趋化因子(CCL2、CCL5)和炎症因子(IL6、TGF-β)的表达。通过RT-qPCR检测在不同培养条件下巨噬细胞表面相关受体(CCR2、CCR5、IL-6R和TGF-βR)表达水平。通过TRRUST数据库分析筛选出共转录因子，并通过细胞免疫荧光和RT-qPCR进一步验证。通过WesternBlotting检测A2aR影响的信号通路。通过设计动物实验来检测A2aR拮抗剂对小鼠异位种植肺癌肿瘤细胞的影响，并通过免疫荧光染色在人组织标本上和通过RT-qPCR在细胞层面上进一步验证。 结果: 生物信息学分析提示A2aR与LUAD患者的预后密切相关，组织免疫荧光染色表明A2aR主要定位在LUAD细胞上，且与巨噬细胞的分布呈正相关(P=0.0067)。Transwell实验结果表明巨噬细胞的迁移依赖于A2aR的高表达，且这种趋化作用会被A2aR拮抗剂(ZM241385)所抑制。在共培养/条件培养时，RT-qPCR检测结果表明高表达A2aR的LUAD表达更高水平的趋化因子(CCL2、CCL5)及炎症因子(IL6、TGF-β)，并且巨噬细胞会表达更高水平的CCR2、CCR5、IL-6R和TGF-βR。通过TRRUST数据库分析、细胞免疫荧光和RT-qPCR进一步筛选确认NF-κB为上述趋化因子及炎症因子的共转录因子。WesternBlotting结果表明拮抗A2aR可以下调LUAD细胞中PI3K、AKT和NF-κB的蛋白表达。体内实验证明A2aR拮抗剂的使用可以有效减轻小鼠肿瘤生长，并可以抑制肿瘤周围的巨噬细胞向M2型转化。人组织免疫荧光染色同样证明A2aR与M2型巨噬细胞显著正相关，体外实验证明拮抗A2aR的LUAD肿瘤细胞的上清液去培养巨噬细胞可降低巨噬细胞M2型标记的表达，增加巨噬细胞M1型标记的表达。 结论: 本研究发现在LUAD中A2aR主要与巨噬细胞的表达显著正相关，高表达A2aR的LUAD肿瘤细胞可以促进巨噬细胞的迁移。A2aR主要通过PI3K/AKT/NF-κB通路调LUAD肿瘤细胞CCL2、CCL5和IL6、TGF-β的分泌，通过增加巨噬细胞CCR2、CCR5、IL-6R和TGF-βR的表达进一步促进巨噬细胞的迁移。此外，拮抗A2aR可以有效抑制小鼠肿瘤生长及巨噬细胞向M2型的转化。因此，针对A2aR免疫检查点的开发有望成为LUAD治疗新策略。
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