摘要
萜类化合物(Terpenoids)是一类在药品、化妆品、生物燃料等行业具有广泛应用价值的天然产物。遗传背景清晰的底盘微生物大肠杆菌通过引入外源甲羟戊酸(MVA)途径能够高效生产许多萜类化合物。然而，此前的研究大多只针对某种特定萜类产物进行路径优化，不能应用于其它萜类产品的生产。因此，随着人们对这些高附加值萜类产品需求的不断提高，开发一种通用平台用于多种萜类化合物的高效生产显得愈发重要。本论文以模式微生物大肠杆菌作为底盘细胞，利用大肠杆菌共培养系统建立了一个基于MVA途径的高效且通用的萜类化合物共培养生产平台。主要研究内容和结果如下: 1、成功构建了萜类化合物的单菌株生产平台。本研究以大肠杆菌单菌株为宿主，在质粒水平上构建了三种不同的MVA途径完整通路来调控MVA途径基因问的相对表达水平。具有中等mvaESEF表达水平的完整MVA途径质粒pSMvL2-M具有相对较高的产物合成能力以及较低的甲羟戊酸积累。但当利用此单菌株体系生产多种萜类化合物时，产量普遍较低。 2、构建并筛选了MVA途径下游通路。基于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)I拘MVA途径相关基因，构建了12种不同组合的MVA途径下游通路，其中含有金黄色葡萄球菌的甲羟戊酸激酶基因SamvaK1、肺炎链球菌的甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶基因SnmvaD和甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因SnmvaK2以及大肠杆菌异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi的MVA途径下游模块具有最佳的催化性能。 3、构建了一个高产甲羟戊酸的大肠杆菌工程菌株。首先，构建了含有粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的乙酰辅酶A转乙酰酶/HMG-COA还原酶mvaEEf和HMG-CoA合成酶nIvaSEf的甲羟戊酸合成质粒pS_MVA并优化甲羟戊酸的宿主菌、生产培养基和诱导剂剂量。结果表明，大肠杆菌DH5α更适宜生产甲羟戊酸；M9Y培养基较2YT培养基更适宜生产甲羟戊酸;而IPTG浓度(0.02mM～0.2mM)对于甲羟戊酸的生产没有显著影响。含pS_MVA的大肠杆菌DH5α工程菌株可以生产3.24g/L的甲羟戊酸。引入异源的(磷酸酮解酶-磷酸转乙酰酶)xPK-PTA旁路可以显著提高乙酰辅酶A的供应，将甲羟戊酸产量提高67.6％，达到5.43g/L。在此基础上，敲除磷酸果糖激酶基因pfk4和过表达粜糖:磷酸醛缩酶基因fbaB和/或果糖-1，6-二磷酸酶基因fbp(强化糖异生途径中甘油醛磷酸GAP到果糖-6-磷酸F6P的转化)并不能促进甲羟戊酸的合成。然而，过表达大肠杆菌内源6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd(强化氧化HMP途径)却可以进一步将甲羟戊酸的产量提高到6.37g/L。当不考虑大肠杆菌细胞生长所消耗的甘油时(假设生长1g细胞需要消耗0.5g的甘油)，甲羟戊酸产量几乎达到理论得率的99.8％。而当甘油供应充足时，甲羟戊酸产量还可以进一步提高到7.21g/L，比合成能力可达1.36g/gDCW。 4、建立了基于大肠杆菌共培养体系的萜类生产平台。本研究利用上游甲羟戊酸高产菌株与下游萜类产物合成菌株构成大肠杆菌共培养体系，可以显著提高多种萜类化合物的产量。α-红没药醇、杜松烯、萑草烯、原伊鲁烯和法尼醇的产量分别可达到454.81mg/L、419.78mg/L、221.57mg/L、310.92mg/L和130.55mg/L，与单培养体系相比，分别提高704％、134％、728％、151％和37.8％。 综上所述，本研究成功在大肠杆菌中构建了基于MVA途径单菌株生产平台，可以实现以甘油为碳源从头合成多种萜类化合物，但产量较低且伴随着甲羟戊酸的积累。利用大肠杆菌共培养体系构建的菌株共培养萜类生产平台可以显著提高多种萜类产物的产量并减少中间产物甲羟戊酸的积累。本研究可为提高其它具有复杂合成通路的化学品提供一种新的思路，同时也为应用菌株共培养体系扩大生产萜类化学品提供参考。
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