摘要
目的: 肺炎克雷伯菌感染已成为院内感染患者死亡的独立高危险因素，它的治疗及预防给临床带来了极大的困难。本研究收集盐城第一人民医院2018年9月至2019年IO月104株非重复肺炎克雷伯菌株，分析其主要的耐药机制、耐药表型、分子分型及临床治疗用药的现状，探查104株菌株的同源性及可能的传播路径，为临床用药和院内感染的防控提供依据。 方法: 1.菌株的收集与保存:收集盐城第一人民医院2018年9月至2019年IO月间肺炎克雷伯菌株，经血平板培养分离纯化后，挑取部分菌落，装进磁珠冻存管里，管上编号从f6648-f6753，最后-80℃条件下冻存。 2.菌株鉴定和药敏试验:使用全自动微生物鉴定系统VITEK2COMPACT进行细菌鉴定并测定相关抗生素最小抑菌浓度;使用改良碳青霉烯类水解实验判断菌株的产碳青霉烯酶表型。 3.耐药基因检测:采用煮沸法分别提取各菌株的DNA，通过PCR扩增的方法对产碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blavrM、blaIMP、blaOXA48）以及多粘菌素耐药基因blamcr-1进行分子检测，并对阳性结果通过Sanger测序进一步鉴定。 4.分子特征研究:通过多重PCR增技术对肺炎克雷伯菌的ST分型(ST11、ST258、ST23、ST65、ST375、ST86)，荚膜血清型(wzyK1、wzyK2、wzyK64、wzyK47)和毒力相关基因（rmpA、rmpA2、iroN、iutA）进行检测。通过脉冲场凝胶电泳（Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE）对肺炎克雷伯菌进行性同源性分析，以此归纳流行病学特征。 5.全基因组测序（Wholegenomesequencing,WGS）:根据菌株所携带的耐药基因及分子特征研究结果，筛选10株菌株进行全基因组测序。根据测序结果，菌株携带的耐药基因和毒力基因都存在差异，单个核苷酸也存在多态性，由此可以分析在院内的可能传播路径。 结果: 1.所收集的104株肺炎克雷伯菌经Vitek2compact系统鉴定，49株对亚胺培南耐药，其余55株则为亚胺培南敏感菌株。 2.根据药物敏感性试验，对亚胺培南耐药的49株菌株对头孢曲松、头孢吡肟、氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦等抗生素的耐药率均为100％:对喹诺酮类药物中的环丙沙星和左氧氟沙星耐药率达到100％;对氨基糖苷类药物中的阿米卡星的耐药率达到了44.9％左右。对亚胺培南敏感的55株菌株对氨苄西林的耐药率为100％;对喹诺酮类药物中的环丙沙星耐药率达50.9％，左氧氟沙星为34.5％;但对氨基糖苷类药物中的阿米卡星的耐药率仅为1.8％。 3.碳青霉烯类水解试验显示对亚胺培南耐药的49株肺炎克雷伯中46株能通过合成碳青霉烯酶获得抗性。 4.通过PCR扩增及序列测定，耐药菌株有46株携带blaKPC-2.2株携带blaOXA-232.未检出blaNDM、blaVIM、blaIMP及blamcr-1基因:敏感菌株有1株携带blaOXA-232,未检出blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP及blamcr-1基因。 5.样本菌株ST分型显示，耐药菌株中20株为ST15，18株为ST11，11株为其他型;敏感菌株以其他型为主。PFGE结果显示104株样本可分为15个克隆型，其中有63株属于同一克隆株，菌株相似度超过80％。 6.结合多重PCR及PFGE分型结果，选取3株携带blaKPC-2，3株携带blaOXA，4株耐药基因全部阴性进行全基因组测序。所有菌株的功能基因数量相近，突变位点数相近，近一半分布于外显子区域;但单个核苷酸多态性的差异，使各菌株所携带的耐药基因和毒力基因等有所不同。 结论: 1.该院肺炎克雷伯菌耐药株，对碳青霉烯类抗生素产生耐药丰要是因为该菌合成KPC酶;肺炎克雷伯菌对常用抗生素的耐药性有逐步上升的趋势，这就要求临床用药需要参考药敏试验结果，不断更新合理化、个体化，甚至联合用药等治疗方案。 2.肺炎克雷伯菌耐药株主要为ST15型和ST11型，PFGE呈高度同源性合10株菌株全基因组测序结果，提示该院肺炎克雷伯菌的单个克隆菌株不但院内广泛传播，而且还可能存在长期定植，在经过较长一段时间后会突变形同菌株，故需进一步加强对肺炎克雷伯菌耐药菌株的连续监测，不断提高院染防控水平。
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