摘要
目的:放射治疗是治疗肿瘤的主要手段之一，而对辐射比较敏感的胃肠道组织，尤其是小肠，极易受到腹盆腔肿瘤放射治疗的影响。尽管多种防护药物和机制通路被研究，但对于辐射引起的肠道损伤尚无十分有效的防治手段。因此开发针对放射性肠损伤新的治疗方法显得十分必要。铁死亡是一种由脂质过氧化引起的铁依赖性细胞死亡，这是一种新发现的调节性细胞死亡形式，其中铁积聚是它的主要特征之一。目前已有研究表明铁死亡在电离辐射介导的组织损伤中起重要作用。但铁死亡与电离辐射介导的肠损伤之间的相互作用尚不十分清楚。本研究首先观察铁死亡与放射性肠损伤的作用关系，随后深入探究Fe在电离辐射介导的铁死亡中的作用机制，以找到治疗放射性肠损伤的潜在靶点。 方法:体外实验:为了探究电离辐射是否可以诱导肠上皮细胞发生铁死亡，给予人正常肠上皮细胞(HIEC)6GyX射线照射，分别在照后0h，24h和48h使用C11-BODIPY荧光探针检测细胞内脂质过氧化水平;利用谷胱甘肽(GSH)试剂盒检测细胞内GSH水平;通过实时荧光定量PCR检测前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)mRNA水平;通过亚铁离子荧光探针检测细胞内Fe2+水平;通过透射电子显微镜检测细胞线粒体超微形态;通过CCK8法检测不同细胞死亡抑制剂对6GyX射线照射HIEC细胞活力的影响。为了研究铁在电离辐射所致肠上皮细胞损伤中的作用及机制，使用去铁胺(DFO)螯合细胞内的铁，检测照射前后细胞内Fe2+、GSH、脂质过氧化及PTGS2、GPX4mRNA水平;使用克隆形成实验查看DFO是否影响肠上皮细胞的放射敏感性。为了探究电离辐射诱导胞内铁含量增加的机制，通过WestemBlot技术检测6Gy辐射后不同时间铁调节相关蛋白转铁蛋白受体1(TfR1)、膜铁转运蛋白1(FPN1)、铁蛋白轻链(FTL)、铁蛋白重链(FTH)及核受体共激活因子4(NCOA4)蛋白表达水平。加入自噬抑制剂3-MA后，通过westemBlot技术检测照后24hTfR1、FPN1、FTL、FTH蛋白表达水平;检测照射前后细胞内Fe2+、GSH、脂质过氧化及PTGS2、GPX4mRNA水平。为了探究辐射致胞内铁水平增加后导致的线粒体损伤效应，使用去铁胺(DFO)螯合细胞内的铁，使用Mito-Tracker查看线粒体形态;利用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化情况;使用Mito-FerroGreen检测线粒体内Fe2+水平;使用ATP检测试剂盒检测ATP水平;使用Mito-SOX检测线粒体内活性氧(ROS)水平;使用实时定量PCR检测线粒体铁转运蛋白2(Mfrn2)和线粒体铁蛋白(Ftmt)水平。 体内实验:为了查看电离辐射是否可以在体内诱导肠上皮细胞发生铁死亡，将C57BL/6J分为对照和全腹14Gy照射两组，照后3.5d取小肠组织通过HE查看肠组织损伤情况;通过免疫组化检测GPX4蛋白水平;使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测组织内铁含量;通过酶标仪检测组织内丙二醛(MDA)和GSH水平。为了观察铁在放射性肠损伤中的作用，在照前三天至照后一天连续给予小鼠100mg/kgDFO腹腔注射处理，然后给予单次14Gy全腹X射线照射，记录30d内小鼠存活时间;将小鼠分为Ctrl、DFO、IR、IR+DFO四组，在照后3.5d取肠组织检测PTGS2、GSH、MDA水平;通过HE染色查看肠绒毛长度;通过尉67免疫组化染色查看增殖细胞数量。 结果:辐照后HIEC细胞内脂质过氧化、PTGS2mRNA、细胞内亚铁离子水平升高，GSH、GPX4水平降低，线粒体嵴缺失或断裂。小鼠受到14Gy全腹照射后，肠组织GPx4、GSH水平降低，PTGS2mRNA、铁含量、MDA水平升高。以上结果表明电离辐射促进了肠上皮细胞中铁死亡的发生。铁死亡抑制剂Fer-1、DFO部分恢复了电离辐射对HIEC细胞活力的影响;DFO处理降低了细胞内亚铁离子积聚，恢复了IR后HIEC细胞存活和GSH、GPX4水平，降低了脂质过氧化和PTGS2mRNA水平;在体内实验中，DFO处理延长和改善了14Gy全腹致死剂量照射小鼠的存活，恢复了照后肠绒毛长度，增加了隐窝中Ki67+细胞数量，恢复了GSH水平，降低了PTGS2mRNA和MDA水平。以上结果表明DFO通过下调细胞内铁水平抑制了辐照介导的肠上皮细胞铁死亡。自噬抑制剂3-MA处理逆转了照射导致的TfR1升高，FTL、FTH下调和铁过载，提示IR导致的铁过载可能源于细胞过度自噬导致的铁蛋白降解(即铁蛋白白噬)。介导铁蛋白自噬的NCOA4mRNA和蛋白在照后增加，进一步证明了此假设。此外，IR诱导的胞内铁过载导致线粒体内铁含量、ROS增加及线粒体形态和功能改变，DFO处理改善了辐射造成的线粒体形态和功能改变，这可能是由线粒体铁调节相关基因Mfrn2和Ftmt的改变所导致的。 结论:1.电离辐射可诱导小肠上皮细胞发生铁过载和铁死亡;2.下调Fe能通过抑制铁死亡有效防治放射性肠损伤，这为放射性肠损伤的防治提供了新的策略。
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