摘要
结直肠癌(Colorectalcancer，CRC)发病率和死亡率居高不下，尤其在年轻人中，其发病率和死亡率正在逐年上升。文献报道，包括CRC在内的多种肿瘤中普遍存在异常选择性剪接，促进肿瘤生长和转移。剪接因子SRSF3在许多细胞功能中发挥着关键作用，如调节RNA剪接和转运等。并且，SRSF3在CRC肿瘤组织中的表达量显著高于正常组织，能够通过调控一系列癌症相关基因的剪接促进CRC发生发展。此外，高表达SRSF3的CRC患者预后较差。因此，SRSF3可能是CRC的潜在治疗靶点，靶向抑制SRSF3具有非常重要的临床意义。然而，目前尚未有SRSF3靶向抑制剂的相关报道。我们前期合成并筛选出了靶向SRSF3的小分子化合物SFI003。基于此，本课题将以CRC为模型，围绕SRSF3在CRC中的作用机制及其抑制剂SFI003的抗肿瘤活性进行研究。 目的 首先，在体外验证SRSF3对CRC细胞增殖、迁移和凋亡的影响，在体内验证SRSF3对CRC肿瘤生长的影响。其次，寻找CRC细胞中SRSF3新的下游靶点，探究SRSF3调控CRC细胞凋亡的具体分子机制。最后，在体内外评价SFI003的抗肿瘤活性，探索其抗肿瘤分子机制。 方法 1.在分子水平上，采用高通量RNA测序(RNAsequencmg，RNA-seq)和KEGG通路富集分析寻找SRSF3的下游靶点。采用蛋白免疫印迹(Westernblot，WB)技术、反转录PCR(RT-PCR)技术、RNA结合蛋白免疫沉淀(RNAimmunoprecipitation，RIP)实验和minigene报告系统实验探究SRSF3对抗氧化酶DHCR24的剪接调控作用。采用Schrodinger软件进行计算机分子对接实验，模拟SRSF3蛋白与SFI003及RNA的结合位点。采用RT-PCR和WB技术探究SFI003对SRSF3和DHCR24的RNA及蛋白水平的影响。采用溶酶体抑制剂CHQ、蛋白酶体抑制剂MG132和Neddylation抑制剂MLN4924探究SFI003诱导SRSF3蛋白降解的途径。采用荧光探针检测法测定SRSF3、DHCR24和SFI003对CRC细胞内活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)水平的影响。采用WB技术探究SFI003对ROS下游Akt/mTOR信号通路的作用。最后，采用ROS清除剂NAC和Trolox探究SFI003调控CRC细胞迁移和凋亡的具体机制。 2.在细胞水平上，采用噻唑蓝(MTT)实验和细胞集落形成实验探究SRSF3、DHCR24和SFI003对CRC细胞增殖能力的影响。采用划痕实验、Transwell细胞迁移实验和WB技术探究SRSF3、DHCR24和SFI003对CRC细胞迁移能力的影响。采用Hoechst染色实验、流式细胞术和WB技术分析SRSF3、DHCR24和SFI003对CRC细胞凋亡的影响。 3.在组织水平上，采用癌症基因组图谱计划(TheCancerGenomeAtlas，TCGA)数据库和临床蛋白质组肿瘤分析协作组(Clinicalproteomictumoranalysisconsortium，CPTAC)数据库分析SRSF3和DHCR24在CRC肿瘤组织及正常组织中的表达情况及临床相关性。采用免疫组化（Immunohischemistry，IHC）技术检测SRSF3和DHCR24在364例CRC组织样本中的表达水平，并分析其与患者各项临床病理特征的相关性。 4.在动物水平上，通过构建稳定敲低SRSF3的CRC细胞株和裸鼠异体移植瘤模型探究SRSF3在体内对CRC肿瘤生长的影响。同时，构建CRC细胞裸鼠移植瘤模型，口服给予小鼠SFI003，检测肿瘤生长曲线和小鼠血清中的生化指标以评价SFI003的抗肿瘤活性及毒性。 结果 1.在TCGA和CPTAC数据库中，SRSF3在CRC肿瘤组织尤其是腺癌组织中的表达量显著高于正常组织;且SRSF3表达量与肿瘤指标Ki67的表达量显著相关(R=0.49，p=1.1×10-23)。在364例CRC肿瘤样本中，有257例(70.6％)样本中的SRSF3表达量显著升高，其表达量同样与腺癌(OR=2.30，p=0.040)和Ki67的表达量显著相关(OR=2.99，p=0.040)。体外功能实验结果显示，在CRC细胞中过表达SRSF3促进了细胞增殖和迁移;反之，敲低SRSF3则抑制了细胞增殖和迁移。同时，敲低SRSF3显著诱导CRC细胞凋亡。在小鼠移植瘤模型中，敲低SRSF3显著抑制了CRC肿瘤生长。 2.RNA-seq及KEGG通路富集分析结果显示，敲低SRSF3后下调的基因主要富集在代谢通路。同时我们发现，敲低SRSF3后DHCR24RNA及蛋白水平均显著降低。RIP实验结果表明SRSF3蛋白可与DHCR24RNA直接结合。Minigene报告系统实验证实SRSF3参与了DHCR24第3和第4号外显子的剪接。在364例CRC肿瘤样本中，有281例(77.2％)样本中DHCR24的表达量显著升高，与腺癌(OR=2.38，p=0.036)、SRSF3的表达量(OR=2.12，p=0.006)和肿瘤指标CA199的表达量(OR=8.89，p=0.016)显著相关。在TCGA和CPTAC数据库中，DHCR24也在CRC组织中高表达，与SRSF3表达量呈正相关(R=0.44，p=4.7×10-19)。此外，敲低SRSF3和DHCR24均引起了CRC细胞内ROS水平升高，且过表达DHCR24挽救了由敲低SRSF3引起的ROS水平升高。敲低DHCR24显著抑制丫CRC细胞增殖和迁移，并诱导细胞凋亡。 3.分子对接实验结果显示SFI003可与SRSF3蛋白结合，且SRSF3蛋白与SFI003和RNA的结合位点不重合。功能实验结果显示，SFI003在体外抑制了CRC细胞增殖和迁移，并诱导CRC细胞凋亡。在小鼠移植瘤模型中，SFI003显著抑制了CRC肿瘤生长，虽然SFI003对小鼠肾功能有一定损伤，但对小鼠肝功能无明显影响。机制研究结果表明，SFI003对CRC细胞中SRSF3RNA水平无影响，但显著抑制了SRSF3蛋白水平，MG132和MLN4924挽救了由SF1003诱导的SRSF3蛋白降解，但CHQ无此效果。此外，SFI003抑制了DHCR24RNA和蛋白水平，诱导胞内ROS水平显著升高，并抑制Akt/mTOR信号通路的激活。ROS抑制剂NAC和Trolox成功挽救了由SFI003诱导的细胞迁移抑制和细胞凋亡。 结论 剪接因子SRSF3及其靶基因抗氧化酶DHCR24在CRC肿瘤组织尤其是腺癌组织中高表达，且SRSF3表达水平与DHCR24及肿瘤生长指标Ki67的表达水平呈正相关。 SRSF3与DHCR24的RNA直接结合，介导其外显子3和4的剪接，从而调控DHCR24的表达。在CRC细胞中，敲低SRSF3可通过抑制DHCR24的表达，引起ROS水平升高，进而诱导细胞凋亡。且SRSF3在体内外均能够促进CRC肿瘤生长，因此靶向SRSF3的小分子化合物SFI003在体内外均显示出较强的抗CRC活性。SFI003能够诱导SRSF3蛋白发生Neddylation修饰后经蛋白酶体途径降解，导致SRSF3蛋白水平降低，从而通过SRSF3/DHCR24/ROS轴抑制AkUmTOR信号通路，诱导细胞凋亡。 本研究阐明了SRSF3及DHCR24在CRC中的促癌作用，为SFI003靶向SRSF3治疗CRC提供了理论依据。
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