摘要
中华按蚊是中国以及东南亚等国家主要的疟疾传播媒介之一，有效防控中华按蚊，切断其传播途径，是该地区控制疟疾的关键。抗击疟疾主要的方法是利用杀虫剂对媒介蚊虫进行控制，但随着杀虫剂的大量使用导致蚊虫的抗药性明显增强，因此迫切需要新型的蚊虫防控策略。随着分子生物学的发展、基因工程技术的完善以及中华按蚊基因组、转录组数据的释放，使得利用转基因以及CRISPR/Cas9基因编辑技术进行蚊虫遗传控制已成为可能。转基因和CRISPR/Cas9技术已成功运用于多种蚊虫，但是在中华按蚊中还无相关报道。本研究旨在建立中华按蚊卵的显微注射方法、建立中华按蚊转基因和CRISPR/Cas9技术体系，为中华按蚊的基因功能研究和基于基因驱动的遗传控制奠定基础。主要研究的技术体系如下： ①中华按蚊卵的显微注射 将所需要的各种设备进行搭配，组装成了一套适合卵收集、排列和注射的显微注射系统，并在此基础上对注射参数、注射方法等进行摸索和优化，建立了适用于中华按蚊卵显微注射的硬件条件和注射方法。中华按蚊卵的显微注射技术的建立为转基因、CRISPR/Cas9等技术的应用奠定了基础。 ②中华按蚊转基因技术体系的建立 基于已经建立的中华按蚊卵显微注射技术体系，通过注射pBac[3xP3-EGFP afm]转基因载体和phsp-pBac辅助质粒建立了中华按蚊的转基因技术体系，包括卵的显微注射、转基因的筛选、插入位点分析和纯合品系建立等。成功建立了两个纯合的EGFP转基因品系，转化率为21.43%。在此基础上，建立了在中华按蚊卵巢中特异表达Cas9基因的转基因品系，为完善中华按蚊的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定了基础。 ③中华按蚊CRISPR/Cas9技术体系的建立 通过在线软件对中华按蚊AsYellow和AsOR7基因的sgRNA靶位点进行分析，并采用注射sgRNA和Cas9蛋白的方式首次实现了CRISPR/Cas9介导的中华按蚊基因组编辑，建立了中华按蚊的CRISPR/Cas9技术体系。对AsYellow和AsOR7基因的靶位点进行分析，都有碱基的插入或缺失而导致的移码突变，突变率分别为8%和18.75%。对潜在的脱靶位点进行分析，未发现非特异性的突变。
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