摘要
目的： 1.利用体外透皮实验检测EGT是否可经皮渗透，观察局部吸收情况。 2.采用UV辐射小鼠皮肤光衰老模型和依托泊苷（Etoposide：EPEG）诱导衰老细胞模型观察EGT对衰老皮肤组织和皮肤细胞的保护活性。 3.探讨EGT抗衰老活性对氧化应激信号通路PI3K/Akt-Nrf2和细胞内源性自然衰老相关信号p38MAPK的影响，探究EGT抗皮肤衰老的可能作用机制，为EGT的应用提供基础。 方法： 1.EGT乳膏剂的体外扩散实验：采用离体SD大鼠皮肤，分为2组，乳膏剂基质组，EGT乳膏剂组，用量为0.2mL/cm2，TPY-2透皮吸收仪上收取2h，4h，6h，8h，12h，24h时接受液。采用高效液相色谱法（HPLC）检测不同时间点EGT的含量，计算EGT的累积渗透量。 2.EGT对UV辐射小鼠皮肤光衰老模型的保护作用及其作用机制研究：将小鼠分为对照组（CTRL），UV辐射组（UV），乳膏剂基质组（UV+Matrix），槲皮素组（UV+Que），低剂量麦角硫因组（UV+0.1mM EGT），中剂量麦角硫因组（UV+1mM EGT），高剂量麦角硫因组（UV+10mM EGT），UV辐射小鼠皮肤前给予乳膏剂，实验结束后取皮肤组织进行病理学检测观察皮肤厚度变化，试剂盒检测皮肤组织中Hyp含量，MDA含量和SOD活性变化，Western Blot实验检测UV小鼠皮肤中胶原蛋白和基质金属蛋白酶、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Keap1、Nrf2、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达量。RT-PCR检测Nrf2及其下游信号分子的转录水平。 3.EGT对EPEG诱导衰老细胞模型的作用及作用机制研究：实验将细胞分为对照组（CTRL），依托泊苷诱导组（10μM EPEG），槲皮素组（10μM Que），低、中、高剂量麦角硫因组（250、500、1000nM EGT），采用10μM EPEG诱导细胞48h后，给予不同剂量的药物干预48h，利用CCK-8实验检测不同浓度药物对HaCaT细胞的活性影响，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）试剂盒检测细胞内SA-β-Gal阳性细胞数，利用免疫荧光检测p16和γ-H2A.X表达，RT-PCR检测细胞内IL-6和TNFα的mRNA水平。Western Blot实验检测PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Keap1、Nrf2、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表达量。 结果： 1.体外扩散实验表明EGT可以经皮渗透，EGT的透皮速率常数为0.3864μg·cm-2·h-1，渗透系数为1.683cm-2·h-1，滞后时间为0.222h，24h时累积透过百分比为19.87±8.184%。 2.HE染色结果表明EGT可减轻由UV辐射引起的小鼠皮肤表皮层变厚。试剂盒检测提示EGT显著增加皮肤中Hyp含量和SOD活性，降低MDA含量。Western Blot实验表明EGT显著增加皮肤中CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表达和降低基质金属蛋白酶（MMPs）蛋白表达，上调磷酸化PI3K和Akt蛋白水平，抑制p38MAPK蛋白表达，激活Nrf2入核。RT-PCR实验表明EGT可上调Nrf2及其靶基因HO-1、Txnrd1、Nqo1和Gpx2的转录水平。 3.CCK-8实验表明1000nM浓度的EGT对HaCaT细胞活性具有抑制作用。试剂盒染色表明给予EGT可显著下调由EPEG诱导的SA-β-Gal阳性细胞数增加，免疫荧光染色及统计结果显示EGT显著下调p16和γ-H2A.X的蛋白表达，RT-PCR结果显示EGT显著降低炎症因子IL-6和TNFα的转录水平。Western Blot实验结果表明EGT上调磷酸化PI3K和Akt蛋白表达，激活Nrf2蛋白表达。给予PI3K抑制剂LY294002后增加HaCaT细胞中p16和γ-H2A.X的表达；给予SB203580后减少HaCaT细胞中p16和γ-H2A.X的表达。 结论： 1.EGT可经皮渗透，24h时累积透过百分比为19.87±8.184%。 2.EGT通过激活PI3K/Akt-Nrf2信号通路和抑制p38MAPK蛋白表达，减轻UV辐射引起的小鼠皮肤光衰老，增强皮肤抗氧化能力，增加皮肤中胶原蛋白含量和降低MMPs表达，发挥抗氧化能力和抗衰老作用。 3.EGT激活PI3K/Akt-Nrf2信号通路抑制由EPEG诱导衰老细胞中衰老相关生物标志物的表达。
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