摘要
急性肝衰竭（acute liver failure,ALF）是短时间内发生肝细胞大量坏死，进而肝脏出现严重功能性损伤，并引起肝性脑病及黄疸、凝血功能障碍，多器官衰竭等并发症的一组临床综合征。ALF病程迅猛，临床致死率高，仍缺乏特效药物或特殊治疗手段。ALF病因复杂，发病机制尚未完全阐明。 ALF早期，大量中性粒细胞急剧浸润至肝组织，释放多种促炎细胞因子和趋化因子，诱发肝脏炎症并加重肝细胞损伤。中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）是中性粒细胞释放的具有免疫调控功能的丝氨酸蛋白酶，参与中性粒细胞胞外捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）的形成。近期的研究显示，NETs具有抗菌、促炎等多种病理生理功能。目前关于NE及NETs介导ALF的作用和机制尚未见报道。 田黄方（Tian-Huang Formula,THF）是广东药科大学郭姣教授创立的中药复方，由三七与黄连配伍组成。前期研究发现THF具有降血糖、血脂、胆固醇作用。依据中医理论，热毒内蕴、瘀血内阻是ALF的中医核心病机。田黄方干预ALF的作用和机制尚不明确。本研究旨在研究田黄方调控NE介导的NET形成、干预ALF的作用和机制。 目的： 1．研究NE药物性抑制剂对于小鼠ALF的干预作用，揭示NE在ALF中的病理生理学功能； 2．研究NETs抑制剂对于小鼠ALF的干预作用； 3．基于NE介导的NETs形成，研究田黄方干预ALF的作用和机制，为中医药防治ALF提供基础研究数据支持。 策略和方法： 1.NE抑制剂干预小鼠实验性ALF的作用与机制研究 通过腹腔注射D-GalN/LPS（0.75mg/g BW;2.5μg/g BW）诱导小鼠ALF模型。经确认的ALF小鼠腹腔注射给予NE抑制剂Sivelestat（150mg/kg），对照组给予空白溶剂。通过评价肝脏坏死程度及肝功能、检测肝脏中性粒细胞浸润程度，NETs的形成，促炎因子及肝细胞凋亡基因的mRNA的表达，研究NE抑制剂干预小鼠ALF的作用与机制。 2.利用抑制剂阻断NETs形成干预ALF的作用与机制研究 GSK484是在NET形成中发挥关键作用的PAD4的抑制剂。本课题对ALF小鼠模型分别腹腔注射给予NETs抑制剂GSK484（20mg/kg）和等量空白溶媒对照。通过评价肝脏坏死程度及肝功能，检测肝脏中性粒细胞浸润程度，炎性因子的mRNA的表达，研究NETs抑制剂干预小鼠实验性ALF的作用与机制。 3.田黄方干预小鼠ALF的作用与机制研究 通过腹腔注射D-GalN/LPS（0.75mg/g;2.5μg/g）诱导小鼠ALF模型。治疗组通过灌胃给予300mg/kg的田黄方，对照组给予生理盐水。通过检测肝脏中NETs的形成研究田黄方调控NETs的功能；评价肝脏坏死程度及肝功能、肝脏中性粒细胞浸润程度，炎性基因及抗氧化基因的mRNA的表达，研究田黄方干预小鼠实验性ALF的作用与机制。 结果： 1.NE药物性抑制剂显著改善小鼠实验性ALF 与ALF空白对照组相比，NE抑制剂Sivelestat治疗组的肝组织坏死显著减少，肝细胞损伤指标ALT与AST活性分别下降60%和30%。IHC和WB结果显示Sivelestat显著降低ALF小鼠肝组织中性粒细胞标志物MPO丰度。免疫荧光结果显示Sivelestat显著减少ALF小鼠肝组织NETs形成。RT-PCR结果显示，NE抑制剂Sivelestat治疗组TNF-α、RIP1、RIP3及HMGB1等促炎细胞因子的mRNA显著下调。 2.GSK484抑制ALF诱发的肝组织NETs形成，改善小鼠ALF 肝组织免疫荧光结果显示，GSK484显著抑制野生型小鼠ALF诱发的NETs形成。与ALF空白对照组相比，NETs抑制剂GSK484治疗组的肝组织坏死面积显著减少，肝细胞损伤指标ALT与AST活性分别下降25%和30%。IHC结果显示GSK484显著降低ALF小鼠肝组织中性粒细胞标志物MPO丰度。Q-PCR结果显示NETs抑制剂GSK484可下调ALF小鼠肝脏中TNF-α的mRNA表达。 3.田黄方调控NETs改善小鼠实验性ALF 肝组织免疫荧光结果显示，田黄方显著减少ALF小鼠肝脏中NETs的形成。与ALF空白对照组相比，田黄方治疗组肝组织坏死面积减少75%；血清转氨酶ALT活力水平降低约35%，AST下降约15%。田黄方治疗组肝组织MPO蛋白丰度显著降低。RT-PCR结果显示田黄方显著下调促炎性基因IL-1β，IL-6和上调抗氧化基因G6pdh mRNA表达。 结论： 1.NE抑制剂Sivelestat通过调控NETs形成，减轻肝脏炎症及减少肝细胞凋亡，改善小鼠ALF； 2.NETs抑制剂GSK484对于小鼠ALF具有显著治疗作用； 3.中药复方田黄方显著抑制ALF小鼠肝脏NETs形成，减轻肝脏炎症和提高肝细胞抗氧化能力，改善小鼠ALF。 综上，本课题研究结果揭示了NE和NETs在介导小鼠ALF中发挥重要病理生理功能，是ALF新药研发（包括中药复方）的潜在靶点。同时，本课题揭示了中药复方“田黄方”具有调控NETs、改善小鼠ALF的作用，支持对该复方治疗ALF的作用和机制进行进一步研究。
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