摘要
中医理论认为中药黄芪经蜜炙后可增强其“补中益气”的作用。前期研究表明，多糖类成分是黄芪补气作用的重要药效物质，且黄芪蜜炙前后，多糖的分子量及单糖组成的比例均发生了变化。本课题分离纯化出蜜炙黄芪精多糖与黄芪精多糖，通过结构表征，比较蜜炙前后多糖结构的差异并探究其在体外对益生菌及菌株代谢产物SCFAs、乳酸和丙酮酸的影响，进一步丰富蜜炙黄芪炮制机理的实验基础。 方法：同一批次的蜜炙黄芪与黄芪药材经加热回流提取、醇沉、酶-Sevage法除蛋白、冻干得到蜜炙黄芪粗多糖HAPS与黄芪粗多糖APS。用DEAE-52阴离子交换柱、FOcurose cL-6B和HW-65F分子排阻柱层析进一步分离纯化得到六个精多糖HAPS2a、APS2a、HAPS2b、APS2b、HAPS3a、APS3a。紫外扫描及凝胶渗透色谱法验证所得样品纯度并测定其相对分子质量，结合液质联用、红外光谱仪、甲基化分析、气质联用、核磁共振分析、三股螺旋结构测定等技术手段对样品进行结构表征。以上述六个精多糖作为培养基的唯一碳源对4种益生菌进行体外培养，并通过酶标仪测定菌株浓度，采用HPLC-GFC-ELSD测定降解多糖的分子量，UPLC/Q-TOF-MS测定降解多糖的单糖组成及代谢产生的SCFAs、乳酸和丙酮酸。 结果：经分离纯化后得到的三个大分子量蜜炙黄芪精多糖HAPS2a、HAPS2b、HAPS3a和三个黄芪精多糖APS2a、APS2b、APS3a，均为同时含有β构型和ɑ构型糖苷键的酸性杂多糖。HAPS2a和APS2a的分子量分别为10009.7kDa和16844.7kDa，均由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara组成，相应的摩尔百分比分别为0.22∶1.47∶0.27∶0.22∶2.44∶50.76∶44.62和0.90∶10.05∶1.10∶8.76∶2.05∶33.52∶43.62，两者在Rha、Gal与GalA的摩尔比例上存在差异；HAPS2a的主链主要由1,3,4-β-Galp、1,6-α-Galp组成，而APS2a的主链主要由1,3,4-α-Galp、1,3,4-β-Rhap、1,6-α-Galp、1,3-α-Rhap组成。HAPS2b与APS2b的分子量分别为5345.7kDa和7664.8kDa，均由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara、Fuc组成，相应的摩尔百分比分别为0.92∶9.27∶0.26∶45.79∶2.02∶15.75∶25.01∶0.98和1.82∶21.41∶1.82∶51.08∶2.17∶11.34∶9.26∶2.91，两者在Rha、Gal和GalA的摩尔比例上存在差异；HAPS2b的主链由1,2,3,4-α-Galp、1,3,4,6-α-Galp、1,2,4-α-GalpA组成，APS2b的主链主要由1,2,3,4-α-GalpA、1,3,4,6-α-GalpA、1,2,4-α-GalpA组成。HAPS3a与APS3a的分子量分别为2463.5kDa和3373.2kDa，均由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara、Fuc组成，相应的摩尔百分比分别为0.4∶13.8∶0.69∶33.24∶2.37∶22.66∶26.18∶0.66和0.25∶14.47∶1.16∶49.55∶0.79∶11.87∶21.47∶0.44，两者在Gal和GalA的摩尔比例上存在差异；HAPS3a和APS3a主链均由1,2,3-β-Rhap、1,4-α-GalpA、1,2,6-β-Galp、1,4-β-Galp和1,2-α-GalpA组成。对4种益生菌的体外培养实验结果表明，HAPS2a、HAPS2b、APS2b、HAPS3a可对BL的生长有较明显的促进作用，仅有HAPS2a与HAPS3a对LGG的生长有明显促进作用，而上述六个精多糖对BO和BT均有明显的促生长作用，代谢产物主要有乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和丙酮酸，但丁酸的含量在APS2a、APS2b、APS3a组中较高，由LGG所产生的乳酸含量在HAPS2a、HAPS2b、HAPS3a组较高。 结论：本实验成功从蜜炙黄芪和黄芪药材中分离纯化出六个均一大分子量酸性杂多糖，多糖在蜜炙前后的分子量、单糖组成比例、糖苷键等方面均存在差异。HAPS2a与HAPS3a对BL、LGG的促生长作用分别较APS2a和APS3a显著；蜜炙黄芪多糖与黄芪多糖对益生菌作用的差异与蜜炙引起的化学结构差异相关。
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