摘要
红曲霉（Monascusspp.）是我国常见的工业菌株，因其能够代谢产生重要的生物色素-红曲色素和多种有益活性物质（莫纳可林K、γ-氨基丁酸等），被广泛应用于生物颜料和保健食品领域。目前对于红曲霉的研究主要集中在其有益代谢产物产量的提高以及其生物合成途径的探究，但由于红曲霉体内代谢复杂，且对于红曲霉的基础研究尚不完全，其体内绝大多数基因功能尚未被探明，导致红曲霉遗传资源的开发相对落后。为了进一步开发红曲霉用途，对于红曲霉基因功能的研究势在必行。 本文以实验室保藏紫色红曲霉（Monascuspurpureus）Mp-21作为研究对象，通过高通量转录组测序获得菌株转录本数据后进行注释分析，并根据转录本注释结果设计引物，克隆出红曲霉繁殖相关基因brlM基因和wetM基因，基于同源重组利用潮霉素抗性hph基因替换紫色红曲霉Mp-21基因组中的brlM基因获得了一株brlM基因缺失菌株△brlM，通过分析△brlM的生长代谢阐明brlM基因的功能，主要研究结果如下： 1、紫色红曲霉转录组高通量测序及分析 利用紫色红曲霉Mp-21和其色素相关基因MpigE基因缺失菌株△pigE作为实验材料，通过转录高通量测序，每个样品获得7.5-8.5Gb的原始数据，经过拼接后得到7219个转录本（Unigenes），并成功注释5692个。两个样品的基因表达量初步富集分析发现两个样品中共492个基因的表达量有明显变化，其中上调199个，下调293个。GO富集结果显示上调基因富集程度最高的主要在：氧化还原酶活性和胞醛代谢过程，下调基因主要在ARF鸟苷酸交换因子活性、催化活性、细胞壁组成和多糖代谢过程。KEGG通路富集分析得到差异基因富集程度最高的通路分别是淀粉和蔗糖代谢通路与碳代谢通路，得到了多个红曲霉体内可能与色素代谢相关的转录本数据。 2、紫色红曲霉繁殖相关基因的克隆和信息学分析 首次从紫色红曲霉Mp-21中克隆出了两个红曲霉繁殖相关的基因brlM和wetM，开放阅读框内长度分别是1182bp和1659bp，分别负责翻译393个和552个氨基酸。进一步对ORF中的序列进行蛋白质序列及结构功能预测发现BrlM蛋白的保守结构域为锌指结构（COG）超家族蛋白，是一种C2H2（cys2his2）型锌指蛋白，并可能参与转录调控。结合同源比对分析发现紫色红曲霉BrlM蛋白质序列与其他丝状真菌分生孢子相关转录调控BrlA蛋白存在50%的相似度，但具有相同保守结构域。紫色红曲霉wetM基因中的ORF序列分析得到的WetA蛋白与其他丝状真菌中的WetA蛋白在最后的90个氨基酸显示出的极高的相似度，有一定的同源性，其保守结构域含有多个结构类型，属于非典型结构域。 3、基于同源重组紫色红曲霉Mp-21brlM基因敲除 根据brlM基因序列分析，在体外构建出一个能够利用hph基因替换brlM基因的敲除载体，并利用根癌农杆菌介导转化法对紫色红曲霉Mp-21进行转化，得到329株红曲霉转化子。最后，通过抗性平板筛选、荧光蛋白观察、PCR验证等方法筛选获得一株brlM基因缺失突变株△brlM。 4、brlM基因缺失株（△brlM）生长代谢分析 对brlM基因缺失株的生长代谢情况进行了分析，研究结果显示：brlM基因缺失株菌落形态、显微结构特征、生长速率和次级代谢方面均发生较大改变。野生型菌株紫色红曲霉Mp-21和△brlM突变菌株相比在PDA中菌落直径差异不大，但在PD液体培养基中菌丝干重要明显低于△brlM。在显微结构方面，△brlM突变菌株在显微条件下无法观察到子囊孢子的产生，但分生孢子要多于野生型菌株紫色红曲霉Mp-21。同时各种次级代谢产物产量（包括红曲色素、桔霉素和洛伐他汀产量）都有明显下降。
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